基于单管巢式PCR和双重PNA钳制反应的循环肿瘤DNA检测新技术

【作者】 陈之遥； 张诗超； 黄晨蓉； 丁成； 李畅； 陈俊； 赵军； 缪丽燕；

【机构】 苏州大学附属第一医院；

【摘要】 目的:循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ct DNA)是一种具有广阔临床应用前景的新型生物标记物,但临床常用的ctDNA检测方法存在灵敏度低、难定量、检测成本高等问题。为此,本研究拟开发一种基于单管巢式PCR和双重肽核酸(PNA)钳制反应的高灵敏、可定量ct DNA检测新技术。方法:本技术利用扩增引物Tm值差异和扩增时退火温度控制,使巢式PCR能在单管中进行,增强了扩增强度和扩增特异性,使拷贝数极低的ct DNA样本的扩增成为了可能;通过野生型特异的PNA探针在巢式PCR外引物扩增和内引物扩增时两次对野生型模板的抑制,来极大程度地抑制了野生型模板的扩增,使血浆中微量ct DNA的检测成为了可能;此外,本技术是用荧光标记突变型特异的锁核酸(LNA)探针进行实时闭管检测,LNA探针能够特异性结合突变型DNA的扩增产物并发出荧光,这样在普通实时荧光PCR仪器上,2 h内就能得到检测结果。结果:本研究建立的新型ctDNA检测技术在100～106拷贝/反应之间具有线性,最低检测限为1拷贝/反应的突变DNA。且能实现对低至0.1?的极微量基因突变的检测。进一步利用本技术对100例组织样本和对应血浆样本的EGFR L858R位点进行了检测。结果显示,在中国人群中,非小细胞肺癌患者肿瘤组织与血浆ctDNA突变检测结果的一致性为78.4%。结论:本研究建立了一种新型的ctDNA检测技术,为临床血浆中极微量ctDNA检测提供了一种高灵敏、可定量、简便快速和低成本的新技术。更多还原