半理性设计氟乙酸脱卤酶RPA1163用于克级立体选择性拆分氟代羧酸的研究

【作者】 张宏霞； 田晒校； 李敏； 童伟； 陈波； 马铭； 王健博；

【机构】 化学生物学和中药分析教育部重点实验室湖南师范大学化学化工学院；

【摘要】 有机氟化物因为其独特的理化性质因此被广泛应用于不同领域,尤其是在制药以及农药领域,上市药物中约20%-30%为含氟有机分子。α-氟代羧酸作为一类有机氟化物的小分子,因为其本身的生物活性以及可以作为有机合成砌块,用于合成更加复杂的具有生物活性的有机氟化物,其合成受到化学家的广泛关注。到目前为止,这一类化合物的混旋体可以很方便地通过化学反应制得,但是如何得到手性纯的单体依旧是一个难题。这里,我们基于以往工作中对氟乙酸脱卤酶RPA1163立体选择性的研究结果,通过重新优化RPA1163的反应条件,发现其对选定的大多数底物都有很好的反应活性以及单一的立体选择性,具有用于手性制备(R)-α-氟代羧酸的潜力。进一步针对相对惰性的底物,通过计算机辅助设计的方法,选定了结合底物活性口袋中的起关键作用的185位的色氨酸,将其定点突变成丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸以及天冬酰胺,活性测试发现,所有突变体针对模式底物的活性均有提高,而W185N和W185T是最好的两个突变体。进一步通过实验和计算建模的方法验证,所得两个突变体通过降低了生成过渡态的能量从而实现了增强活性的目的。最终结合野生型以及两个突变体优异的反应性能,我们实现了10种α-氟代羧酸的克级拆分,同时得到了R型的α-氟代羧酸以及R型的α-羟基羧酸两种产物。这一工作不仅拓展了氟乙酸脱卤酶用于手性拆分的新用途,而且加深了我们对该蛋白催化碳氟键断裂的酶学机理探讨,同时也展示了计算机辅助设计蛋白改造的高效与精确。更多还原