前导肽和同工酶共表达提高脂肪酶的毕赤酵母重组表达

【作者】 蔡海莺； 张婷； 张琪； 罗洁； 葛展榜； 李江； 俞韩科； 崔斌； 余越明； 毛克宇； 王珍珍； 毛旸晨； 蔡成岗； 毛建卫； 冯凤琴；

【机构】 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心浙江科技学院生物与化学工程学院； 浙江大学生物系统工程与食品科学学院； 杭州医学院；

【摘要】 较低的表达水平是酶制剂的价格居高不下,并限制其作为生物催化剂在工业应用的重要因素之一。脂肪酶前导肽可作为分子伴侣影响其成熟蛋白的许多性质。然而,前导肽作用机制可能不同。本研究的主要目的是通过研究疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）五肽前导肽对其在毕赤酵母重组表达中的影响确定前导肽的作用,探讨其可能的作用机制与疏水性的关系。不含前导肽TL基因、含前导肽PTL基因和k TL基因被放克隆到表达载体p PIC9K分别获得到pP-TL、pP-PTL和p P-kTL。以PP-PTL质粒为模板,利用定点突变获得PTL-P和PTL-VP前导肽变体,并用于在毕赤酵母中重组表达。测定脂肪酶酶活、热稳定性和分子动力学模拟。重组菌脂肪酶活性GS-PTL平均水平达到434.32 U/mL,高于GS-TL 377.71 U/mL。修饰肽重组菌株的发酵结果表明,GS PTL VP变胞外脂肪酶酶活可达到483.29 U/mL,提高了11.27%,GS PTL相比（434.32 U/ml）。进一步对脂肪酶稳定性、前导肽变体的分子动力学模拟表明,PTL和前导肽变体PTL-VP的RMSD相似。本研究表明,前导肽"SPIRR"序列有利于提高TLL在毕赤酵母中的重组表达。此外,该前导肽的功能被确定为其疏水性相关,表明前导肽可能有助于协助疏水核心的形成,促进蛋白质的折叠过程。本研究表明其他脂肪酶前导肽也可能有助于提高脂肪酶重组表达、结构折叠和酶学性质改善。本研究还尝试利用脂肪酶同工酶的表达策略提高催化同一反应的脂肪酶同工酶在表达系统中的整体表达水平。我们设计并构建了4种脂肪酶同工酶的共表达方法,并确定和比较不同脂肪酶同工酶在毕赤酵母中的共表达效率。结果表明,脂肪酶同工酶的Kex2介导的共表达成功表达了米黑根毛霉（Rhizomucor miehei lipase,RML）和疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyceslanuginosuslipase,TLL）,同时,和GS-RMk-kTL菌株显示平均脂肪酶活性为306.91 U mL^-1,高于独立重组表达毕赤酵母菌株GS-RML和GS-KTL(2.89 U mL^-1和300.59 U mL^-1),及两者之和(303.48 U mL^-1)。结果表明Kex2介导的同工酶共表达具有提高脂肪酶整体重组表达水平的潜力。然而,由于RML较低的毕赤酵母重组表达,同工酶共表达菌株的脂肪酶整体提升效应显著降低。另外,同工酶融合表达同样实现脂肪酶共表达,但脂肪酶活性较低。此外,2A断裂肽能成功介导脂肪酶同工酶的表达和胞外分泌,但显著降低2A断裂肽下游的脂肪酶TLL表达水平和分泌。更多还原