抗CD20人源化抗体L4H5的构建、表达与功能研究

【作者】 靳彦文； 朱林； 彭莉； 李平； 曹诚；

【机构】 军事医学科学院生物工程研究所；

【摘要】 目的:非霍奇金淋巴瘤(NHL)是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一,发病率和死亡率也成逐年上升趋势。利妥昔单抗(Rituximab)的出现改变了NHL的治疗状况,并成为目前最成功的抗肿瘤药物;然而,它在临床上产生的人抗鼠抗体反应(HAMA)太大而影响其治疗效果,需要人源或人源化抗体来解决其不良反应。方法和结果:本研究利用计算机模拟技术从人抗体库中筛选并改造出构象与Rituximab相似的人源化抗体库,包含7条重链序列和5条轻链序列,分别组合出L3H3、L4H5、L4H6、L4H7、L5H5、L5H6等13种抗体。利用重叠PCR技术获取抗体重链与轻链的核苷酸序列,并将其分别构建到表达载体p Opti VEC与pc DNA3.3上。将含重链与轻链序列的载体按照上述13种抗体的组合方式分别转染到DG44细胞(CHO DHFR-细胞株)中,通过选择培养基Opti CHO及利用氨基糖苷类抗生素G418进行双重筛选以获得重组细胞株。对每个重组细胞株进行悬浮培养,加入氨基蝶呤(MTX)获得高浓度的抗体。利用Western blot和ELISA检测抗体重链轻链的表达及抗体的产量。经过protein A层析柱获取纯化抗体,用ELISA检测其与抗原表位间的亲和力。首先选用商品化CD20抗原肽检测与人源化抗体间的亲和力,ELISA结果表明L4H5与CD20抗原的亲和力最强,为商品Rituximab的1.7倍;随后据文献报道我们又合成了CD20抗原表位肽,ELISA结果显示抗体L3H3、L4H5和L5H7的亲和力均优于Rituximab,其中L4H5与新合成CD20抗原表位的亲和力为Rituximab的2.2倍。结论:发现了3种亲和力均优于Rituximab的人源化抗体,其中L4H5与新合成CD20抗原表位的亲和力为Rituximab的2.2倍,有望成为一种新的治疗NHL的药物。下一步需要采用流式细胞仪检测L3H3、L4H5和L5H7这三种抗体与抗原的亲和力,以及动物实验验证这三种抗体在体内抑制肿瘤的生物活性。更多还原