【作者】 易善勇； 官丽莉； 杨晶； 黄建； 姜潮；

【机构】 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心； 吉林农业大学生命科学学院；

【摘要】 利用植物油体表达系统生产蛋白,是生物反应器研究的热点。具有生产成本低、来源广、易于大规模生产、不含危害人类健康的病原生物等优点,并且重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存。肝细胞生长因子(HGF)是1984年Nakamura从肝部分切除的鼠血浆中分离和部分纯化并命名的,成熟HGF是由重链(α链)与轻链(β链)通过链间二硫键连接而成的异二聚体。HGF的主要功能:(1)具有促进血管内皮细胞增生和新生血管形成的作用,可以用于治疗各种原因所致组织缺血性疾病。(2)HGF还能调节胶原纤维的合成和炎性反应,在治疗创伤愈合、防治组织纤维化中起着重要的作用。(3)HGF还可促进组织细胞的发生、生存和再生,抑制细胞凋亡,对神经有营养作用,可用于预防和治疗神经损伤。作为具有多种生物学功能的细胞因子,它在病毒性肝炎、肿瘤、心血管疾病和神经保护等方面的作用是近年研究的热点之一。其来源主要是从人血浆和胎盘中提取纯化。但机体内HGF浓度很低,超过100L的人血浆仅能提取50～100μg HGF,超过50个人胎盘仅可获得1mgHGF。这样制备HGF既费时、费力,且成本高昂。因此,利用基因工程表达人HGF(hHGF)是大量获取具生物活性HGF的有效途径。而利用植物油体表达系统表达HGF不仅价格低廉,而且植物来源广,易于大规模生产,可大大降低生产成本。因此本实验探索利用拟南芥和红花的种子来特异性表达HGF。目的:探索利用拟南芥和红花的种子来特异性表达HGF,为利用植物油体表达系统生产药用蛋白奠定了基础。方法:1、植物表达载体p OTBar-HGF的构建:将HGF基因进行植物偏好性优化合成后插入到油体融合蛋白植物高效表达载体上,形成p OTBar-HGF重组质粒,利用冻融法将重组质粒转化至农杆菌EHA105中。2、农杆菌介导的拟南芥转化:采用Flora-Dip法侵染拟南芥,后经过Basta筛选后获得转基因株系,对转基因拟南芥种子进行蛋白水平上的检测:(1)SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白oleosin-HGF已成功在转基因拟南芥种子中得到表达。(2)酶活实验结果表明:利用转基因拟南芥种子表达的oleosin-HGF具有肝细胞生长因子活性。3、农杆菌介导的红花转化:以新疆裕民无刺红花为植物材料,利用农杆菌介导法,对红花进行遗传转化。用含1%Basta的培养基进行转基因植株抗性筛选,获得抗性苗。进行PCR检测,结果显示:重组蛋白HGF已成功整合到转基因红花基因组中。结果:利用转基因拟南芥和红花种子成功地特异性表达了人HGF(hHGF),并获得了转基因拟南芥T3代和转基因红花T2代。结论:实验结果为利用植物油体表达系统生产药用蛋白奠定了基础,同时提供了一个可能使用的大规模生产hHGF的方法。更多还原