牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立

【作者】 陈祥； 徐正中； 单法； 单锋丽； 孟闯； 焦新安；

【机构】 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心；

【摘要】 目的本研究旨在建立一种牛γ干扰素ELISPOT检测方法,并评价该方法用于牛结核病检测的价值。方法通过筛选与天然牛γ干扰素特异性结合的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体,并探索不同的实验条件确定最佳包被抗体浓度、最佳细胞浓度和最佳检测抗体浓度等,建立牛γ干扰素ELISPOT检测方法。采集30头奶牛尾静脉血并分离外周血单个核细胞,以结核菌素作为刺激原,使用建立的ELISPOT检测方法进行牛结核病检测,并与BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果进行比较。结果筛选到两株与天然抗原特异性结合的牛γ干扰素单抗2G5和5E11,确定ELISPOT检测方法的最佳实验条件为:包被抗体2G5浓度2.5μg/m L,每孔细胞数量2.5×105个,检测抗体Bio-5E11浓度1μg/m L。使用建立的ELISPOT检测方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒对30头奶牛进行同步检测,结果显示,以BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准,14头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阳性牛中,ELISPOT方法检出的阳性牛为11头,敏感性为78.6%(11/14);16头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阴性牛中,ELISPOT方法检出的阴性牛为12头,特异性为75%(12/16)。结论应用结核菌素作为刺激原的牛γ干扰素ELISPOT检测方法可用于牛结核病辅助检测,具有潜在的临床应用价值。更多还原