植物特有转录因子CCT基因的功能解析

【作者】 申翠翠； 刘海洋； 官泽源； 闫俊杰； 郑婷； 鄢文豪； 吴昌银； 张启发； 殷平； 邢永忠；

【机构】 作物遗传改良国家重点实验室和国家植物基因研究中心； 长江大学农学院； 华中农业大学生命科学技术学院； 华中农业大学植物科学技术学院；

【摘要】 CCT基因是指编码蛋白包含CCT （CONSTANS,CONSTANS-LIKE and TOC1）结构域的基因的统称,该家族的基因目前主要在植物中有被发现,并参与光周期响应、生物钟核心振荡器的形成、春化作用、抗旱、抗病等多种生物反应;尤其是光周期响应,CCT基因在不同物种的光周期介导开花调控途径中都发挥着关键作用。CCT基因发挥转录因子功能主要依赖于CCT结构域,CCT结构域中包含核定位信号,同时也是结合DNA的必需元件,但是CCT结构域是如何结合并识别DNA的分子机制一直不清楚。在水稻的抽穗期研究中鉴定出一批主效调控因子Ghd7、Ghd8、Ghd7.1和Ghd6/Hd1,除了Ghd8之外其他基因分别属于CCT基因的三个亚家族CMF（只包含CCT保守结构域,如Ghd7）、PRR（包含RR结构域和CCT结构域,如Ghd7.1）和COL（包含B-BOX结构域和CCT结构域,如Hd1）。通过遗传分析我们发现属于NF-Y家族的Ghd8和这三个CCT基因之间都存在遗传互作,结合荧光素酶互补实验、pull-down和分子筛层析等方法证实Ghd7、Ghd7.1和Hd1都可以通过CCT结构域与Ghd8和Os NF-YC2形成稳定的蛋白复合物。为了进一步探索这个三元复合物是否具有DNA结合活性,我们首选需要筛选CCT结构域结合的DNA序列。此前已知Hd1能结合到Hd3a启动子上发挥调控功能,通过对结合的DNA区段进行饱和突变我们发现Hd1^CCT/Ghd8/OsNF-YC2偏好结合具有CCACA motif的DNA序列。用这一序列与Hd1^CCT,Ghd8/OsNF-YC2和Hd1^CCT/Ghd8/OsNF-YC2复合物分别进行EMSA和ITC测试结合活性发现Hd1^CCT/Ghd8/OsNF-YC2复合物对DNA的结合活性显著高于单个的蛋白或者二元复合物,同时对Ghd7和Ghd7.1也进行了测试发现结果与Hd1类似,说明CCT必须要与NF-YB/C形成稳定的三元蛋白复合物才具有完整的DNA结合活性。在此基础之上我们进一步解析了Hd1^CCT/Ghd8/OsNF-YC2结合DNA的晶体结构,发现Hd1通过位于CCT结构域的后半段进行DNA的识别,尤其是R363、R372和F377这三个位置的氨基酸对于DNA的识别至关重要;同时CCT结构域前半段通过与Ghd8/OsNF-YC2互作形成稳定的三元复合物维持稳定构象,Ghd8/OsNF-YC2同时也通过与DNA磷酸骨架互作来增强复合物对DNA的结合能力。最终,我们证实了CCT结构域都需要与NF-YB/C形成复合物来进行DNA识别,解析了CCT家族基因发挥转录因子功能的分子机制,为其他CCT基因的分子机制研究和进一步利用CCT基因进行精确的分子改良打下了坚实的基础。更多还原