Bn.YCO影响油菜叶绿体的发育和叶绿体基因的转录

【作者】 刘婷婷； 傅廷栋； 祝利霞； 沈金雄；

【机构】 华中农业大学/作物遗传改良国家重点实验室； 济南大学生物科学技术学院；

【摘要】 【研究背景】甘蓝型油菜(Brassica napus)是世界上重要的油料作物之一,也是中国的重要油料作物,其产油量大约占中国食用植物油总量的大约55%。叶绿体是植物、藻类和一些原生生物中特有的细胞器,是光合作用的主要场所。它可以利用太阳能,将二氧化碳和水转化为有机物,为生物的生长发育提供必要的能量。因此,叶绿体的正常发育对作物的生长至关重要,是影响作物产量的关键因素。在油菜中,有关叶绿体的研究还处于初级阶段。目前应用广泛的CRISPR/Cas9技术为油菜基因的功能研究提供便利;【材料与方法】本研究以华中农业大学工程中心提供的甘蓝型油菜T6为转基因受体材料,构建Bn.YCO的CRISRP/Cas9株系和GUS转基因株系。同时,利用pM999-35S-GFP和pCAMBIA2300为载体骨架,分别构建Bn.YCO的亚细胞定位载体和GUS载体。通过透射电镜观察基因敲除株系中叶绿体的发育,并以油菜茎秆、叶片、花、角果和不同发育时期的子叶为材料,qRT-PCR检测Bn.YCO的表达。通过qRT-PCR和转录组测序分析叶绿体发育相关基因的变化;【结果与分析】利用CRISPR/Cas9技术在油菜中同时敲除Bn.YCO基因的两个拷贝BnaA01.YCO(BnaA01g00180D)和BnaC01.YCO(BnaC01g01100D)。转基因阳性植株叶片为花斑状,叶绿素含量降低,叶绿素合成基因下调表达。靶位点测序后发现,在花斑状植株中,Bn.YCO两个拷贝发生不同类型的碱基插入缺失突变。T1代Bn.yco突变体呈现子叶黄化、真叶为花斑状或白化表型。通过透射电镜观察发现,在花斑状叶片中,叶绿体形态异常,无法观察到内部的类囊体膜结构。在播种后14天的突变体子叶中,叶绿体疑似已经被降解,并且观察到质体小球聚集。亚细胞定位结果显示,Bn.YCO在叶绿体中表达。对不同组织的Bn.YCO表达量分析发现,Bn.YCO在叶片中表达量相对较高,在根和角果中几乎检测不到其表达。在发芽后1天和2天的子叶中,Bn.YCO的表达量升高,在发芽后3天的子叶中,表达量下降至与萌发期基本持平。同时,在基因敲除株系中,叶绿体基因的m RNA水平显著下降。Bn.yco突变体黄化子叶和野生型绿色子叶转录组分析结果显示,在突变体中,共有7,740个基因上调表达,10,831个基因下调表达。其中,参与核糖体组装过程的基因表达水平显著下降。此外,光合系统蛋白编码基因也显著下调表达;【结论】在植物生长发育过程中,叶绿体的正常发育至关重要。Bn.YCO基因的突变影响叶绿体类囊体膜的形成,同时导致叶绿体基因转录水平降低。综上所述,Bn.YCO在甘蓝型油菜叶绿体发育中发挥重要作用。更多还原