块茎富油的油莎豆CeDGAT2-2基因功能分析与燃油型烟草的培育

【作者】 高宇； 孙岩； 高慧玲； 薛金爱； 贾小云； 李润植；

【机构】 山西农业大学农学院；

【摘要】 【研究背景】为消除普通油料作物用于生物燃油生产对全球粮食安全的威胁,培育富油的非粮能源植物是发展可再生绿色生物能源的有效途径。油莎豆(Cyperusesculentus)块茎富含油脂(>30%)、且主要成分为油酸(18:1Δ9)(>65%),是生产高品质食用油和生物柴油的优异资源。然而,油莎豆块茎油脂合成及调控机制还未解析。二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)催化酰基-CoA和二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)生成三酰甘油(triacylglycerol,TAG),是植物种子油脂合成积累的限速酶。本文从DGAT2基因入手,系统鉴定分析油莎豆CeDGAT2基因及生物学功能,并进一步应用于在高生物量烟草(Nicotiana tabacum)营养器官组装油脂富集途径,以培育燃油型烟草新种质。【材料与方法】本研究以油莎豆晋农1号发育块茎为试材,进行转录组分析,全基因组鉴定油莎豆CeDGAT基因家族成员并分离其cDNA克隆。在TAG-缺陷型酵母突变体H1246异源表达各基因并鉴定各成员酶蛋白活性及底物特异性。选择在块茎中高表达的CeDGAT2-2和转录因子CeERF基因,在普通烟草营养器官异源共表达,培育高量积累油酸和总油脂的燃油型烟草新种质。【结果与分析】系统分析油莎豆发育块茎转录组数据,获得3个Ce DGAT基因,即CeDGAT1,CeDGAT2-1和CeDGAT2-2。qRT-PCR检测显示CeDGAT2-2基因在发育块茎中高量表达,且与块茎油脂快速积累时期吻合。在TAG合成缺陷酵母H1246菌株中异源表达CeDGAT2-2,可使缺陷型酵母完全恢复TAG合成,表明CeDGAT2-2编码的酶蛋白有DGAT酶活性。进一步在培养基中分别添加不同脂肪酸,饲喂转基因酵母试验显示,CeDGAT2-2对油酸有强烈的底物选择性。在普通烟草组成型异源表达CeDGAT2-2,且以拟南芥AtDGAT1和大豆Gm DGAT1用作阳性对照。转基因烟草植株表型鉴定显示,过表达CeDGAT2-2基因的烟叶中总脂含量显著增加,比野生型、AtDGAT1和Gm DGAT1转基因烟叶均有提高。CeDGAT2-2过表达亦导致烟叶组织中脂肪酸成分及含量的改变,不饱和脂肪酸的水平(18:1和18:2)增加,而饱和脂肪酸(16:0和C18:0)的含量相应减少,尤其是18:1含量显著上升,从野生型的5.1%增加至转基因烟叶的31.33%。CeDGAT2-2转基因烟草叶片中淀粉含量由野生型的10.67%减少至6.46%,可溶性糖含量增加了1.07%,蛋白含量并未发现明显的变化。转基因植株总叶绿素含量和种子发芽率未发现显著变化,这说明CeDGAT2-2异源过表达没有对烟草植株的生长和其他农艺性状造成不良影响。此外,转录组分析还发现1个转录因子CeERF基因在油莎豆发育块茎中高量表达,且与油脂积累趋势一致。在烟叶中过表达CeERF明显上调了脂肪酸合成途径上游酶基因的表达,促进烟叶总油脂积累。进一步共表达CeERF和CeDGAT2-2基因,获得了烟叶组织总油脂和油酸含量更高、且其他农艺性状良好的烟草新种质。【结论】本文鉴定获得参与油莎豆块茎油脂合成及调控2个重要基因,CeDGAT2-2编码的酶蛋白具有较高的DGAT酶活性,且对油酸有极强的底物选择性。CeERF编码的转录因子能上调脂肪酸合成途径上游酶基因表达。在烟草中共表达CeDGAT2-2和CeERF,显著促进碳源更多地进入脂肪酸和油脂生物合成途径,增大TAG积累的库容量,最终导致烟叶总油脂和油酸的高水平积累,且对光合作用、植物生长、种子发芽和其他农艺性状无负效应。富含油酸和总油脂的燃油型烟草新种质为绿色生物燃油的可持续生产奠定了优异生物资源。更多还原