TNF-α/NLRP3/Vimentin信号通路在隐球菌脑膜炎血脑屏障通透性改变中的作用及其机制

【作者】 刘玲娟； 肖阳阳； 熊洁； 王爱平； 黄鹏； 许洁； 毛定安； 刘利群；

【机构】 中南大学湘雅二医院儿科； 中南大学湘雅二医院儿童脑发育与脑损伤研究室；

【摘要】 目的隐球菌性脑膜炎是一类致死性中枢神经系统感染性疾病,严重危害着儿童的健康,而有关隐球菌脑膜炎的发生发展机制仍是当前急需解决的问题。宿主细胞蛋白Vimentin通过激活信号因子NF-κB参与了细菌性脑膜炎后血脑屏障通透性的调节,且该蛋白可能与炎症小体NLRP3的激活有。因此,本实验旨在研究TNF-α/NLRP3/Vimentin信号通路是否参与了隐球菌脑膜炎后血脑屏障通透性的调控。方法 (1)通过尾静脉注射致病性隐球菌、非致病性隐球菌及生理盐水至SD大鼠体内制作隐球菌脑膜炎模型,分别于干预后2h,24h,72h,7d断头取脑,分离大脑皮质,收集脑脊液,应用墨汁染色检测干预后72h各组脑脊液中的隐球菌数量,WB及实时定量PCR检测各大脑皮质内TNF-α、Vimentin、NF-κB (总蛋白及核蛋白)、NLRP3的表达量,TUNEL检测干预72h后各脑组织中的细胞凋亡。(2)体外培养人脑血管内皮细胞(HBMEC),分别应用致病性隐球菌、非致病性隐球菌及生理盐水干预,24h后收集细胞,流式细胞术检测各组细胞的凋亡;ELISA检测各组细胞的通透性;WB及实时定量PCR检测各组细胞内TNF-α、Vimentin、NLRP3及NF-κB (总蛋白及核蛋白)的表达,免疫荧光法检测各组细胞Vimentin+NF-κB共转染。(3)体外构建TNF-αsiRNA及NLRP3 siRNA,分别将其与siRNA control转染至体外培养的HBMEC,WB检测转染成功率;应用致病性隐球菌干预siRNA转染后的HBMEC,随后应用流式细胞学检测各组细胞的凋亡;ELISA检测各组细胞的通透性;WB及实时定量PCR检测各组细胞内TNF-α、Vimentin、NF-κB及NLRP3的表达,免疫荧光法检测各组细胞Vimentin+NF-κB共转染。结果 (1)致病性隐球菌干预后各时间点TNF-α、Vimentin、NF-κB (总蛋白及核蛋白)、NLRP3的表达量较正常对照组显著上升,在72h时达高峰,随后逐渐下调,且72h后细胞凋亡较对照组显著增多。(2)隐球菌干预后HBMEC内TNF-α、Vimentin、NF-κB (总蛋白及核蛋白)、NLRP3亦较对照组显著上调,细胞通透性显著升高,细胞凋亡明显增多。(3)应用TNF-αsiRNA及NLRP3 siRNA分别干预HBMEC相应蛋白表达,结果发现,TNF-α抑制后Vimentin、NF-κB及NLRP3的表达较对照组显著减少,而NLRP3抑制后HBMEC内TNF-α的表达并无明显改变,但Vimentin、NF-κB的表达显著减减少,且两者的抑制均能显著减少隐球菌干预后HBMEC的凋亡,改善HBMEC通透性。结论Vimentin蛋白通过激活信号因子NF-κB,并诱导其从胞浆转入胞核内,加重血脑屏障通透性损伤,该过程与TNF-α及NLRP3具有显著相关性,两者通过负性调控Vimentin的表达减少细胞凋亡,显著改善隐球菌脑膜炎后血脑屏障通透性,减缓脑损伤进程。更多还原