抗乙肝药物的体外筛选及相关机制研究

【作者】 娄晓月； 陈文娟； 彭有梅； 王亚峰；

【机构】 郑州大学药学院； 河南省(郑州大学)医药科学研究院；

【摘要】 目的乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是嗜肝性DNA病毒,可引起急性或慢性的病毒性肝炎,进一步发生为肝纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌。目前慢性肝炎的治疗手段主要是抗病毒治疗,常用药物有干扰素类和核苷(酸)类似物。干扰素通过抗病毒与免疫调节双重机制作用,但其治疗效果一般且使用不便,临床应用受到很大限制。核苷类似物口服给药方便、生物利用度高、抗病毒疗效显著,在临床上应用广泛,但其不能彻底清除体内病毒且需长期用药,易产生耐药性。因此,本课题采用野生型HBV细胞株HepG2.2.15细胞和拉米夫定耐药细胞株HepGRL1细胞(本实验室成功构建)作为体外细胞模型,对10种中药化合物体外抗乙肝病毒活性及其作用机制进行研究,为寻找新型抗乙肝病毒药物奠定基础。方法①细胞毒性检测:HepG2.2.15和HepGRL1细胞分别于96孔板培养过夜,含药培养液作用3天,MTT法检测化合物的细胞毒性。②检测化合物对HBV s和e抗原的抑制作用:两种细胞分别于96孔板中培养过夜,含药培养液作用6天(每3天换液1次),收集上清,ELISA法检测化合物对HBV s和e抗原表达的抑制作用。③检测化合物对HBV DNA的抑制作用:两种细胞分别于24孔板培养过夜,含药培养液作用6天,分别收集上清液和细胞,FQ-PCR法检测化合物对细胞内、外HBVDNA含量的影响。④检测化合物对HBVX基因表达水平的影响:两种细胞分别于12孔板培养过夜,含药培养液作用6天,最终收集细胞,提取RNA并反转录,RT-PCR法检测化合物对细胞内HBVX基因表达水平的影响。结果①MTT结果显示化合物对HepG22.2.15和HepGRL1两种细胞的毒性作用并求出TC50值。②ELISA结果显示化合物yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b在HepG2.2.15细胞中,对HBV s和e抗原皆具较强抑制作用;在HepGRL1细胞中,对HBV e抗原仍具有较强的抑制作用。③FQ-PCR结果表明yxy1741、yxy1483e、yxy1483c显著抑制HepG2.2.15和HepGRL1细胞上清及细胞内HBVDNA的复制,且与空白组相比,抑制率超过50%。④RT-PCR结果表明yxy1483e对HepG2.2.15和HepGRL1细胞内HBV X基因mRNA的表达均有明显的抑制作用。结论研究表明,yxy1741、yxy1483e、yxy1483c三种化合物无论对野生型HBV细胞株还是拉米夫定耐药细胞株皆展现出较好的HBV抗原抑制作用,同时能有效抑制细胞上清及细胞内HBV DNA的复制,并且抑制细胞内HBV X基因mRNA的表达。其中,化合物yxy1483e的细胞毒性小,对HBV抗原、细胞内外HBV DNA以及细胞内HBV X基因表达的抑制作用最为显著,有望开发为新型的抗HBV药物,并且对拉米夫定耐药治疗提供理论指导。更多还原