犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

【作者】 柳方远； 印春生； 李双星； 单虎； 才学鹏； 刘业兵；

【机构】 中国兽医药品监察所；

【摘要】 为建立犬弓形虫抗体间接ELISA （iELISA）诊断方法,本试验对弓形虫ME49基因进行重组表达,将获取的重组蛋白（C18）进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度,优化包被条件、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了犬弓形虫抗体iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为1ng/ul,血清最佳稀释度为1:200,酶标二抗最佳稀释度为1:4000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为5%BSA封闭2h。临界值为0.288,待检血清OD_450nm值>0.288则确定为阳性。重复性试验中变异系数均低于10%,重复性良好;与CPIV、CRV、CDV、CPV、CAV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;将犬弓形虫阳性血清稀释至1:3200仍显示为阳性,敏感性好。对57份犬的临床血清进行检测,阳性率为65%。本试验建立了一种快速有效的诊断犬弓形虫抗体的iELISA方法,为犬感染弓形虫病的检测奠定基础。更多还原