玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及其在动物组织与饲料中的ELISA快速检测方法研究

【作者】 董国良； 刘振利； 谢长清； 韩肖亚； 袁宗辉； 彭大鹏；

【机构】 国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部兽药残留检测重点实验室； 农业部食品安全评价重点开放实验室； 华中农业大学；

【摘要】 [目的]本研究拟通过半抗原设计、抗原合成和单克隆抗体制备,制备一种玉米赤霉烯酮的广谱单克隆抗体,并研制相应的ELISA检测试剂盒,用于动物可食性组织和动物饲料中此类毒素的筛选检测。[方法]本研究以玉米赤霉烯酮为原料连接羧甲基羟胺（CMO）,合成半抗原ZEN-CMO,分别与大分子蛋白KLH、BSA、HSA和OVA进行偶联,制备完全抗原ZEN-CMO-KLH、ZEN-CMO-BSA、ZEN-CMO-HSA和ZEN-CMO-OVA。以玉米赤霉烯酮为原料合成半抗原7-NH₂-ZEN,通过戊二醛（GA）法与BSA连接,制备完全抗原7-NH₂-ZEN-GA-BSA。将人工抗原ZEN-CMO-BSA/HSA/KLH和7-NH₂-ZEN-GA-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,监测小鼠血清效价和特异性。通过单克隆技术筛选杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生法制备单克隆抗体。以ZEN-CMO-OVA为包被原、ZEN为竞争物,优化ELISA条件,建立间接竞争ELISA方法。按1、2、4倍定量限（LOQ）向玉米、猪饲料、猪肉、猪肝脏、猪肾脏和牛奶样品中添加ZEN标准溶液。样品经前处理后用制备的单克隆抗体进行ELISA检测,研制试剂盒产品。[结果]半抗原经质谱鉴定合成成功,人工抗原经紫外分光光度计鉴定成功。动物免疫后,经筛选,获得单克隆杂交瘤细胞株ZEN/6C2,该杂交瘤细胞株的染色体数平均为100.7,经鉴定亚型为IgG₁。ELISA优化结果表明,包被原最佳浓度为1μg mL^-1,单克隆抗体的最佳稀释度为1:64000;标准曲线回归方程为y=（A-D）/[1+（x/C）^{^B}]+D,A=0.97351,B=7.47822,C=2.03041,D=0.07020,R²=0.99977,IC₅₀值为114.0±5.0ng L^-1（n=5）,线性范围10～6250ng L^-1。标准曲线的板内和板间变异系数均小于15%,灵敏度为11.3ng L^-1。该抗体对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的交叉反应率分别为89.5%、39.3%、99.2%、55.5%和44.3%。样品添加实验结果表明药物回收率为62.9%～113.6%,批内和批间变异系数均小于15%,结果表明药物说明该ELISA方法的准确性和重复性良好。通过与液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对比考核,该ELISA方法与LC-MS/MS方法相关性良好,相关系数为0.995,表明该ELISA方法的检测结果切实可靠。[结论]本研究制备了一种能够同时识别玉米赤霉烯酮及其5种代谢产物的广谱单克隆抗体,与国内外同类抗体相比灵敏度较高,广谱性好;基于该抗体建立了玉米、饲料、动物可食性组织及牛奶中玉米赤霉烯酮及其5种代谢物的ELISA检测方法,填补了该方法在动物可食性组织和牛奶中玉米赤霉烯酮类霉菌毒素检测的空白,为玉米赤霉烯酮类霉菌毒素多残留酶联免疫检测产品的研发奠定了基础,具有较高的学术价值和广阔的应用前景。更多还原