CpxR对鼠伤寒沙门菌的黏菌素耐药相关通路PmrAB和PhoPQ的调控作用

【作者】 翟亚军； 孙华润； 罗行炜； 刘建华； 潘玉善； 吴华； 苑丽； 贺丹丹； 胡功政；

【机构】 河南农业大学牧医工程学院；

【摘要】 [目的]前期研究发现cpxR在acrB和cpxR双缺失株JSΔacrBΔcpxR::kan/pcpxR (JSΔΔ/pR)中出现超临界表达且JSΔΔ/pR的黏菌素敏感性较标准株JS显著升高了16倍。为了深入分析CpxR对沙门菌的黏菌素耐药相关通路PmrAB和PhoPQ的调控机制,为寻找新的药物作用靶点提供理论依据。[方法]用凝胶迁移滞后实验(EMSAs)分析了CpxR蛋白与黏菌素耐药相关基因pmrAB、phoPQ、mgrB、pmrC、pmrH和pmrD的启动子区的结合情况。用电喷雾质谱(ESI-MS)测定了JS、JSΔacrBΔcpxR::kan(JSΔΔ)、JSΔΔ/pR中类脂A的L-4-氨基阿拉伯糖(L-Ara4N)和磷酸乙醇胺(pEtN)的修饰情况。用overlapping PCR扩增得到了cpxR-pmrB、cpxR-phoQ、cpxR-pmrD共表达基因,构建了pmrB、phoQ、pmrD的单基因过表达菌株JSΔacrBΔcpxR::kan/ppmrB (JSΔΔ/pB)、JSΔacrBΔcpxR::kan/pphoQ(JSΔΔ/pQ)、JSΔacrBΔcpxR::kan/ppmrD (JSΔΔ/pD)和cpxR-pmrB、cpxR、cpxR-pmrD共表达菌株JSΔacrBΔcpxR::kan/pcpxR-pmrB (JSΔΔ/pRB)、JSΔacrBΔcpxR::kan/pcpxR-phoQ (JSΔΔ/pRQ)、JSΔacrBΔcpxR::kan/pcpxR-pmrD (JSΔΔ/pRD),并用2倍微量肉汤稀释法测定了各菌株对黏菌素的最小抑菌浓度(MICs)。用小鼠体内竞争试验和体外竞争试验分析了黏菌素相对较敏感的菌株JSΔΔ/pR的适应性代价。[结果]发现CpxR能够与phoPQ、pmrC、pmrH和pmrD的启动子区域结合,但不能与pmrAB和mgrB的启动子区域结合。ESI-MS试验发现JSΔΔ/pR中L-Ara4N和pEtN修饰的类脂A含量显著下降。成功构建了鼠伤寒沙门菌的黏菌素耐药相关基因pmrB、phoQ和pmrD的单基因表达株JSΔΔ/pB、JSΔΔ/pQ、JSΔΔ/pD及cpxR-pmrB、cpxR-phoQ、cpxR-pmrD共表达株JSΔΔ/pRB、JSΔΔ/pRQ、JSΔΔ/pRD。发现cpxR缺失时,pmrB和phoQ过表达使沙门菌的黏菌素敏感性下降,而当cpxR与pmrB和phoQ共表达后沙门菌对黏菌素的敏感性显著上升。pmrD过表达对沙门菌的黏菌素敏感性没有显著影响,而当cpxR与pmrD共表达后沙门菌对黏菌素的耐药性较JS上升了16倍。小鼠体内竞争试验和体外竞争试验表明黏菌素相对较敏感的JSΔΔ/pR存在适应性代价。[结论]CpxR能够通过调控黏菌素耐药相关通路PmrAB和PhoPQ的相关基因调控鼠伤寒沙门菌对黏菌素的敏感性。更多还原