沙门菌多重耐药蛋白AcrB突变体的耐药性和耐药机制

【作者】 杨玲； 常满霞； 林晓玲； 蒋红霞；

【机构】 华南农业大学兽医学院；

【摘要】 [目的]主动外排系统AcrAB-TolC外排底物广泛,是沙门菌产生多重耐药的主要原因。本研究意在了解临床耐药沙门菌中外排蛋白AcrB的突变对细菌耐药性的作用和作用机制。[方法]检测临床沙门菌中的AcrB突变;通过定点突变获得AcrB突变体。采用微量肉汤稀释法测定突变体对多种药物的敏感性;利用圆二色谱与BN-PAGE实验检测AcrB突变体蛋白稳定性;通过同源建模获得AcrB和AcrAB蛋白模拟结构;并利用定点突变、药敏实验与荧光标记实验对突变位点的耐药机制进行研究。[结果]在临床沙门中检测到两种AcrB突变,AcrBM78I单突变和AcrBM78I/319L双突变。所有携带AcrB突变的菌株均对环丙沙星高水平耐药。AcrB突变体的药物敏感性结果显示,AcrB的M78I和P319L突变均可增强细菌对氟喹诺酮类药物、红霉素、新生霉素和胆盐的耐药性。圆二色谱结果显示,单突变对蛋白光谱影响较小,双突变与野生型相比差异较大,同时AcrB319L突变体的熔解温度比AcrBWT的降低了近1℃,而AcrB78I/319L双突变的熔解温度又有所恢复;BN-PAGE结果表明,AcrB78I和319L突变并没有改变AcrB三聚体的稳定性。荧光底物标记结果表明,78位氨基酸突变疏水性增强使得底物与外排通路中的某些氨基酸位点(如位点Q89和E673)结合增强。通过对AcrA中367位和368位氨基酸进行定点突变,并分析其药物敏感性和AcrB319位于这两个氨基酸的结构关系,发现AcrBP319L的突变导致细菌的耐药性增加,是因为氨基酸L比P具有更长和更灵活的侧链,这使得AcrB与AcrA的相互作用更灵敏,使AcrB的功能性蠕动更加灵活,从而具有更高效的底物外排能力。[结论]本研究揭示了临床沙门菌中外排蛋白AcrBM78I和P319L的突变对菌株多重耐药性的发展具有重要作用。更多还原