N端融合检测标签的pMDC32植物表达载体系列的构建

【作者】 左登攀； 陈相儒； 赵添羽； 张永亮； 王颖； 王献兵； 李大伟； 于嘉林； 韩成贵；

【机构】 中国农业大学植物病理学系农业生物技术国家重点实验室；

【摘要】 Gateway植物表达载体pMDC32主要组成元件包括启动子、Gateway盒(attR1-ccdB-attR2)、终止子和用于选择转基因植物的筛选标记基因。所用的启动子是组成型启动子为烟草花叶病毒(CaMV)双增强启动子(2×CaMV 35S)。本实验室已在表达载体pMDC32attR2区C端插入3*Flag序列的pMDC32-MCS-3*flag载体,为了便于实验中目的基因N端融合检测标签,本文在以pMDC32为骨架基础上进一步构建了可在目的蛋白N端带有3*Flag、3*HA和3*Flag-3*HA检测标签的系列表达载体,分别命名为pMDC32-3*Flag-MCS、pMDC32-3*HA-MCS和pMDC32-3*Flag-3*HA-MCS,3种载体构建策略分别如下。首先合成了3*Flag-3*HA基因并连在pUC57-simple-225载体上,通过KpnⅠ/Sa/Ⅰ双酶切获得3*Flag-3*HA (KpnⅠ/SalⅠ)片段,插入已用KpnⅠ/SalⅠ双酶切获得pMDC32 (KpnⅠ/SalⅠ)线性化载体中,获得重组载体pMDC32-3*Flag-3*HA-MCS,表达目的蛋白时可根据多克隆位点酶切插入基因(插入目的基因5′端可使用HindIII/SalⅠ酶切位点,3′端可使用PacⅠ/SpeⅠ/SacI)。pMDC32-3*Flag-MCS构建首先基于携带3*Flag-3×HA基因的pUC57-simple-225载体PCR扩增3*Flag(KpnⅠ/SpeI)片段,再将3*Flag(KpnⅠ/SpeⅠ)片段插入已用KpnⅠ/SpeⅠ双酶切获得的pMDC32 (KpnⅠ/SpeⅠ)线性化载体中,获得pMDC32-3*Flag-MCS重组载体,表达目的蛋白时可根据多克隆位点酶切插入基因(插入目的基因5′端使用SPeI酶切位点,3′端使用SacⅠ)。pMDC32-3*HA-MCS构建以pMDC32-3*Flag-3*HA-MCS载体以BamHI/BglⅡ进行双酶切后回收pMDC32-3*HA的载体,自连接获得pMDC32-3*HA-MCS重组载体,表达目的蛋白时可根据多克隆位点酶切插入基因(插入目的基因5′端可使用HindⅢ/SalⅠ酶切位点,3’端可使用PacⅠ/SpeⅠ/SacⅠ)。本实验对Gateway表达载体pMDC32改造后获得N端带有检测标签的载体,均能够在植物中进行瞬时表达目的基因及进行转基因遗传转化,并获得很好的表达效果,为重要基因功能研究及植物遗传转化获得转基因遗传材料提供了便利。更多还原