建立樱桃中快速高效检测樱桃病毒A的重组酶聚合酶扩增技术体系

【作者】 陈玲； 段续伟； 张开春； 张晓明； 王晶； 闫国华； 周宇；

【机构】 北京市林业果树科学研究院农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室北京市落叶果树工程技术研究中心；

【摘要】 樱桃病毒A （Cherry virus A,CVA）是β线形病毒科（Betaflexiviridae）发型病毒属（Capiovirus）成员,分布较广,在我国已广泛传播。CVA寄主范围广泛,常见于甜樱桃和酸樱桃,前期研究发现CVA通常与侵染樱桃的一至多种病毒存在复合侵染。针对CVA的高发性,本研究从NCBI上收集了位于不同地理位置,不同进化组的24个CVA全序列,根据CVA外壳蛋白保守区域设计特异性引物（F:5’-GATGAAGATATTGTCAATCCTCCAA CTGTG-3′,R:5’-Biotin-CTGTCTCTTGCTTCTG GCATGATACCTTCT-3′）和探针（Probe:5′-FAM-TGGCACTCATTGACGTCAGTGTTGACCAGAG-THF-TTCAGGAAAGGTGGTTTC-PO₄-3’）,建立了在樱桃中检测CVA的等温DNA扩增技术,即重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术。利用TwistAmp^TM nfo试剂盒建立的RPA技术在恒温38℃的条件下反应40min完成,经PCR产物纯化试剂盒回收后电泳,正向和反向引物扩增获得138 bp的扩增子,TA克隆后测序正确,加探针后获得110 bP的扩增子。灵敏性试验表明该RPA技术的灵敏性是PCR技术的10倍,并且与国内侵染樱桃的其他6种病毒原（PNRSV、PDV、CGRMV、CNRMV、PBNSPaV、LChV2）和1种类病毒（HSVd）无交叉反应。此外,获得的具有标记的扩增子可通过侧向流试纸条检测进行直观观察,便于CVA检测的高通量应用。田间样品检测进一步证实了该方法的实用性。以上结果表明本研究开发的CVA RPA检测技术具有简单、快速、灵敏及特异等特点,能用于田间任何生长季的樱桃样品是否被CVA侵染的常规检测。更多还原