甜瓜蚜传黄化病毒运动蛋白的原核表达、纯化和抗血清的制备

【作者】 时兴； 张绍康； 左登攀； 姜宁； 张晓艳； 王颖； 于嘉林； 李大伟； 韩成贵；

【机构】 中国农业大学植物病理学系农业生物技术国家重点实验室；

【摘要】 甜瓜蚜传黄化病毒(Melon aphid-borne yellows virus,MABYV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),由蚜虫以持久非增殖型方式传播。MABYV既可以单一侵染,也可以和马铃薯卷叶病毒属的其他病毒复合侵染,病毒侵染局限于寄主植物韧皮部,被侵染叶片发生黄化和增厚,影响田间植株产量和品质。近年来,葫芦科作物因感染MABYV而发病的面积不断扩大,造成严重经济损失。MABYV为正义单链RNA (+ssRNA)病毒,病毒粒子正二十面体球形,由180个蛋白亚基按照T=3排列形成,直径为25～30nm。病毒基因组全长约5.7kb,共含有7个开放阅读框(ORFs),编码7个蛋白。运动蛋白MP (191 aa)由ORF4 (3 544～4 119nt)通过渗透扫描表达,在MABYV传播、复制和表达过程中发挥重要作用。对于MABYV的检测,主要利用RTPCR技术,而有关于MABYV的血清学检测尚未见正式报道。为了制备抗血清检测甜瓜蚜传黄化病毒及其运动蛋白,首先将MABYV的MP构建到原核表达载体pDB.His.MBP上,通过转化大肠杆菌BL21 (DE3),利用0.1 mmol/L的IPTG在18℃条件下诱导培养16 h,经超声破碎和Ni亲和层析柱纯化,得到高浓度和纯度的MP融合蛋白。然后将总量约为3mg的表达蛋白作为抗原免疫健康的新西兰大白兔,制备并获得抗血清。最后,利用该抗血清进行了Westem-blot检测,发现该抗血清能够检测到在本生烟接种叶上瞬时表达的MABYV运动蛋白,效价、灵敏度高且特异性好。更多还原