南瓜蚜传黄化病毒运动蛋白的原核表达、纯化和抗血清的制备

【作者】 张绍康； 赵添羽； 左登攀； 时兴； 王颖； 张宗英； 李大伟； 于嘉林； 韩成贵；

【机构】 中国农业大学植物病理学系农业生物技术国家重点实验室；

【摘要】 南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)是侵染葫芦科作物的重要病毒,属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)。该病毒于1992年在法国首次报道,局限在寄主植物韧皮部组织,主要通过两种蚜虫(Myzus persicae和Aphis gossypii)以持久循回型和非增殖方式传播。近年来,由CABYV侵染引起的葫芦科作物病毒病在我国发生面积不断扩大,严重影响了葫芦科作物的产量及品质,造成严重经济损失,CABYV既可以单一侵染,也可以复合侵染,典型症状是引起叶片的黄化和增厚,造成田间植株约减产50%。CABYV为正义单链RNA (+ssRNA)病毒,具有直径为25～30 nm的正二十面体球形病毒粒子。病毒粒子较稳定,对氯仿和非离子去垢剂不敏感,但在高盐条件下长时间处理会被破坏。CABYV基因组全长约5.7 kb,共含有7个开放阅读框(ORFs),编码7个蛋白,前3个ORF通过基因组RNA表达,后4个通过亚基因组RNA表达,其中ORF4编码南瓜蚜传黄化病毒运动蛋白(CABYV-MP蛋白),通过渗透扫描表达,可定位在胞间连丝,在病毒复制和移动过程中发挥重要调节作用。本研究利用实验室保存的CABYV全长cDNA克隆扩增获得CABYV-MP片段,成功构建到PDB-his-MBP原核表达载体上转化大肠杆菌菌株Rosetta,经0.2 mmol/L IPTG诱导后通过镍柱亲和层析并使用不同浓度的咪唑洗脱液进行洗脱。SDS-PAGE检测选择最优浓度浓缩获得CABYV-MP纯化蛋白。将此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备获得多克隆抗血清。Western Blot结果表明,所制备的抗血清效价高达1:1 000 000,稀释倍数为1:100 000时在显色效果和经济角度较为理想。此抗血清可以检测到稀释128倍的感病样品,且不与同属内的其他病毒发生血清学交叉反应,为CABYV的检测以及MP功能的深入研究提供材料基础。更多还原