生姜茎基腐病原菌环介导等温扩增技术快速检测体系的建立

【作者】 王静琰； 张博； 祁凯； 张悦丽； 马立国； 齐军山； 李长松；

【机构】 山东省农业科学院植物保护研究所； 烟台大学生命科学院；

【摘要】 生姜茎基腐病是生姜主产区发生严重的病害之一,为典型的土传病害和种子传播病害,为害造成根部和茎基部腐烂,一般损失20%～30%,严重可达50%以上。经分离鉴定发现是由多种腐霉菌(Pyhtium)侵染引起,以群结腐霉(P.myriotylum)、林栖腐霉(P.sylvaticum)为主。为了进一步研究病害的发生规律与预警,建立病菌快速检测技术十分必要,目前针对生姜茎基腐病菌常用的检测技术为普通PCR等分子生物学方法,存在对仪器设备及操作人员要求高且耗时长等缺点,不利于向基层技术部门推广。本研究所采用的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术,通过比对林栖腐霉与其他腐霉菌的基因序列,筛选有序列特异性的基因作为靶标来设计LAMP特异性引物,从而建立一种可通过颜色判定的检测体系,能在短时间内实现DNA的大量扩增,具有快速、准确、简便的特点。该体系为25μL,扩增前在反应管管盖内侧加入SYBR Green I作为指示剂,在等温条件65℃下进行核酸扩增反应60 min,80℃10min灭活DNA Polymerase,将反应管离心1min后即可通过肉眼直接观察结果,SYBR Green I显示绿色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。该体系对DNA的最低检测限为100pg/μL。本研究建立了一种针对林栖腐霉的快速检测技术,为其他病原腐霉菌快速检测体系的建立和以腐霉菌侵染引起生姜茎基腐病的快速诊断提供了技术支撑和理论依据。更多还原