携带外源基因的重组脑心肌炎病毒构建及病毒拯救

【作者】 袁万哲； 戚妍； 王建昌； 张若曦； 李睿文； 李丽敏； 孙继国；

【机构】 河北农业大学动物医学院； 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心； 河北省动物疫病预防控制中心； 河北省兽医生物技术工程技术研究中心；

【摘要】 脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)能引发猪脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍,并能通过猪器官移植感染人,严重危害养猪健康与公共卫生安全。世界上大多数养猪国家都有该病的发生和流行,我国从病原学和血清学方面已经证实猪群存在EMCV的感染。本研究利用反向遗传操作技术成功构建了EMCV BD2株的cDNA感染性克隆。根据EMCV BD2全基因组序列,运设计覆盖病毒全基因组的三对重叠引物,在扩增全长的上游引物中加入SP6 RNA聚合酶启动子核心序列。在基因组第6256位引入点突变,将突变的限制性酶切位点EcoR I作为本次感染性克隆试验的遗传标记。然后将这三个片段依次克隆至已改造的低拷贝载体pWSK29,经测序显示,该全长质粒成功引入了SP6原核启动子,5’-UTR的poly(C)长度为31nt,3’-UTR的poly(A)长度为18 nt。pWSKBD2全长质粒经BamH I酶切线化、体外转录,得到具有感染性的EMCV RNA,经脂质体2000转染BHK-21细胞,24h后出现典型的细胞病变(CPE),收集培养上清,连续传至5代后,经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证实获得具有感染性的拯救病毒,命名RvEMCV/BD2。第5代恢复病毒TCID 50达到108/mL。一步生长曲线显示,拯救病毒RvEMCV/BD2在BHK-21细胞上的增殖特点与亲本毒株相似。已有研究表明,Mengo病毒可以作为活病毒载体将外源基因序列插入其先导蛋白中并成功表达该蛋白,因为EMCV与Mengo病毒同属于心病毒属,它们的先导蛋白具有很高的同源性,所以EMCV先导蛋白也具有容纳和表达外源片段的能力,这一结果已经得到证实。本试验基于构建好的EMCV感染性克隆全长质粒,在编码病毒先导蛋白的L基因中插入猪圆环病毒(PCV2)的ORF2基因,经体外转录,拯救出具有感染性的重组病毒,将其命名为RvEMCV/BD2-ORF2。结果表明该拯救病毒可在BHK-21细胞上增殖并可以稳定携带外源基因,这为利用EMCV作为活病毒载体提供了理论基因与技术平台。更多还原