利用PiggyBac转座系统构建稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系

【作者】 胡跃； 孙英杰； 王晓旭； 仇旭升； 宋翠萍； 谭磊； 胡桂学； 丁铲；

【机构】 吉林农业大学动物科技学院； 中国农业科学院上海兽医研究所； 安徽农业大学；

【摘要】 维甲酸诱导基因I型(retinoic acid inducible gene-I,RIG-I)是最近几年才发现的一种细胞内的模式识别受体,能够特异性的识别并结合病毒的RNA,进而发挥抗病毒效应,是机体先天性免疫的重要组成部分。在病毒感染机体、在细胞内复制增殖时,RIG-I能特异性地识别并结合这一过程中所产生的RNA,改变自身构象,与下游接头分子结合,开启信号通路,最终使机体发挥先天性免疫作用。RIG-I在进化中是保守的,鸡基因组内没有RIG-I基因,鸭和鹅则具有完整的RIG-I基因。新城疫和禽流感每次爆发都造成鸡的大面积感染,RIG-I可以识别并结合这两种病毒在细胞内复制时产生的RNA,这两者中是否存在联系,引起了很多研究人员的兴趣。本试验利用PiggyBac转座子系统,构建稳定表达鹅源RIG-I基因的鸡胚成纤维细胞(DF-1)系,为后续的试验研究奠定基础。本试验主要内容和结果如下:1.稳定表达鹅源RIG-I的鸡胚成纤维细胞的构建根据GenBank上的RIG-I序列,结合PiggyBac-513B-1载体序列设计出引物,以质粒Flag-RIG-I为模板进行PCR扩增,经酶切后将RIG-I与载体PiggyBac-513B-1相连,转染入细胞后使用嘌呤霉素进行筛选,经两次亚克隆获得单细胞株,将单细胞持续传代,收集样品验证稳定性。2.稳定表达细胞系的鉴定经两次亚克隆的细胞株持续传代,在第1代、第5代、第10代、第15代、第20代、第30代收取样品,分别用RT-PCR及Western Blot验证m RNA水平和蛋白水平RIG-I基因的表达情况,再以免疫荧光辅助验证,结果表明构建的细胞系持续传代性良好,可用于后续试验。更多还原