Spred3基因突变与经EGFR-TKI Erlotinib持续处理的NSCLC细胞HCC827产生的对TKI耐药性的相关性

【作者】 廖锦容； 王强； 陈超； 何志勇； 苏颖；

【机构】 福建省肿瘤医院；

【摘要】 目的:EGFR-TKI是治疗EGFR突变激活晚期非小细胞肺癌的重要手段,影响治疗效果最大的问题是对TKI产生获得性耐药,目前获得性耐药机制仍有部分未见阐明。利用全外显子测序技术鉴定EGFR-TKI耐药细胞的基因突变情况,探讨筛选出的耐药基因对TKI的耐药机制。方法:对EGFR突变活化的人非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR-TKI敏感细胞株HCC827细胞在TKI Erlotinib浓度递增的培养条件下筛选出TKI Erlotinib耐药细胞株为HCC827/ER。全外显子测序检测HCC827和HCC827/ER细胞的基因突变情况。荧光定量PCR检测Spred3的表达水平。Western Blot检测Spred3、p-p44/42、p44/42、pAKT、AKT的表达水平。MTS细胞活性检测各细胞株的IC50.Transwell迁移实验检测处理细胞株的细胞迁移能力。结果:全外显子测序结果显示在HCC827/ER相比于HCC827中Spred3 1号外显子发生c.120delG突变,频率为100%;AXL 4号外显子发生c.27delC突变,频率为57%。荧光定量及Western Blot显示在HCC827/ER中,Spred3的m RNA和蛋白水平几乎不表达.Western Blot、MTS细胞活性分析和Transwell迁移实验显示在HCC827中敲除Spred3(HCC827/Spred3-sg),使其Spred3表达下降,且对TKI的的耐受能力以及细胞迁移能力增强。在HCC827/ER细胞中过表达Spred3,则使其对TKI的耐受能力以及细胞迁移能力降低。在无血清培养基中经表皮生长因子EGF处理30min的情况下,HCC827/ER相比于HCC827中Ras/Raf/MAPK和PI3K/AKT信号通路激活效果显著。在完全培养基中HCC827/Spred3-sg相比于其对照组HCC827/AAV-sg,Ras/Raf/MAPK和PI3K/AKT通路激活效果显著。在HCC827/Spred3-sg/ERK1/2 inhibitor(即HCC827/Spred3-sg在ERK1/2 inhibitor处理30min时)相比于HCC827/Spred3-sg,Ras/Raf/MAPK和PI3K/AKT信号通路得到抑制。HCC827/Spred3-sg/ERK1/2 inhibitor相比于HCC827/Spred3-sg对TKI的耐受能力以及细胞迁移能力下降。结论:全外显子测序检测TKI erlotinib浓度递增的方法诱导并筛选的TKI耐药细胞HCC827/ER中Spred3c.120delG突变发生频率100%,Spred3m RNA及蛋白几乎不表达;通过基因组中Spred3突变,使得蛋白失活而致Ras/Raf/MAPK信号通路活化而诱导HCC827/ER对TKI Erlotinib的耐药,可能是EGFR活化突变的NSCLC细胞HCC827经诱导产生获得性耐药的机制之一。更多还原