MiR-7及靶基因KLF4在鸡原代成肌细胞增殖和分化中的机制研究

【作者】 陈福祥； 吴鹏飞； 李婷婷； 何明亮； 殷学梅； 段严军； 张涛； 谢恺舟； 王金玉； 张跟喜；

【机构】 扬州大学；

【摘要】 本课题组前期通过RNA-seq测序发现mi R-7在京海黄鸡原代成肌细胞(CPMs)的增殖期(GM)高表达,在分化期(DM)表达持续下降,而KLF4基因表达趋势与mi R-7正好相反,两者可能在胚胎期骨骼肌发育过程发挥重要作用。为了进一步阐明mi R-7的功能及其作用机制,本研究通过RT-PCR检测了mi R-7和KLF4基因在京海黄鸡胚胎期骨骼肌中的表达趋势,相关分析表明两者在胸肌和腿肌中均存在强负相关;通过双荧光素酶试验发现mi R-7和KLF4基因存在靶向关系(P<0.01);过表达mi R-7后抑制KLF4基因表达,干扰mi R-7后促进了KLF4基因表达;同时检测了CPMs增殖期和分化期中mi R-7和KLF4基因表达趋势,通过皮尔森相关性分析发现两者依然存在负相关关系。挽救实验表明,同时转染mi R-7和KLF4基因能够促进细胞的增殖。上述试验结果表明KLF4基因是mi R-7的靶基因,两者在成肌细胞中存在负调控关系。同时在CPMs中转染mimic和inhibitor来过表达和干扰mi R-7,通过RT-PCR、Edu和CCK-8检测发现过表达mi R-7会抑制CPMs的增殖,干扰mi R-7会促进CPMs增殖;通过间接免疫荧光、RT-PCR和WB试验检测发现过表达mi R-7会减少肌管面积(P<0.01),抑制CPMs的分化,干扰mi R-7会增加肌管面积(P<0.05),促进CPMs的分化。上述试验结果表明mi R-7在CPMs中具有抑制成肌细胞增殖和抑制成肌细胞分化功能。通过RT-PCR、Edu、CCK-8和间接免疫荧光检测CPMs增殖和分化,发现干扰KLF4基因会显著抑制CPMs增殖和分化,减少肌管面积(P<0.01);过表达KLF4基因能显著促进CPMs增殖和分化,增加肌管面积(P<0.05)。综上,在鸡原代成肌细胞中mi R-7通过靶向调控KLF4基因抑制成肌细胞细胞增殖和分化,研究结果为解析成肌细胞增殖分化的分子机制提供了坚实的基础。更多还原