骨质疏松症易感区域1p36.12非编码SNP通过远距离成环调控LINC00339的机制研究

【作者】 杨铁林； 陈晓峰； 段媛媛； 朱东丽； 郭燕；

【机构】 西安交通大学生命科学与技术学院生物医学信息工程教育部重点实验室；

【摘要】 全基因组关联分析(genome-wide association studies, GWAS)已成功鉴定数百个与骨质疏松症相关的风险易感变异,其中基因座1p36.12存在多个骨质疏松症相关易感变异,已被多项独立研究重复验证,提示其参与骨调控的潜在关键作用。然而,1p36.12区域关联信号复杂,大部分易感变异均位于基因组非编码区,目前并不清楚真正的关键调控性变异及功能靶基因。本研究通过整合基因组,转录组和表观组分析,发现了1p36.12区域的一个潜在关键的独立调控性风险变异(rs6426749)。联合表达数量基因座分析(expression quantitative trait locus, eQTL)和高通量染色质互作分析(highthroughput chromosome interaction assay, Hi-C),我们发现rs6426749可能通过远距离成环调控一个长链非编码RNA LINC00339表达(～360kb)。利用前成骨细胞hFOB1.19,我们进一步通过荧光素酶报告实验和CRISPR-Cas9以及dCas-KRAB基因编辑实验,证明了rs6426749-G碱基特异性增强远距离靶基因LINC00339的表达。我们发现染色质成环蛋白CTCF显著富集于rs6426749以及LINC00339启动子附近,通过hFOB1.19细胞基因沉默实验,我们验证了CTCF对于rs6426749-LINC00339远距离成环具有重要调控作用。通过生物信息学分析,我们发现TFAP2A特异性结合于rs6426749-G碱基。通过h FOB1.19细胞染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)实验,我们证明了TFAP2A能结合rs6426749片段。进一步的基因敲除实验和荧光素酶报告-基因敲除共转实验,证明了TFAP2A通过特异性结合于rs6426749-G碱基,激活增强子活性,增强靶基因LINC00339表达。下游生物信息学分析和基因沉默实验证明LINC00339负调控CDC42表达。CDC42是一个已知的骨代谢相关明星基因,提示其可能是LINC00339参与骨代谢的关键调控靶基因。综上,本研究首次解析了骨质疏松症热点易感区1p36.12的关键调控性变异及功能靶基因,并首次在骨质疏松症中验证了一种新的远距离成环的分子调控机制,为骨质疏松症GWAS易感变异功能机制解析提供了全新思路,也为进一步解析骨质疏松症遗传机理和开发新的药物靶标奠定了基础。更多还原