基于染色体分拣及二代测序技术内含子靶向的外源染色体特异分子标记的开发

【作者】 王海燕； 代渴丽； 肖进； 袁春霞； 赵仁慧； Jaroslav Dole?el； 吴玉峰； 曹爱忠； 陈佩度； 张守忠； 王秀娥；

【机构】 南京农业大学细胞遗传研究所作物遗传与种质创新国家重点实验室；

【摘要】 簇毛麦(Haynaldiavillosa,VV,2n=14)是普通小麦的二倍体近缘物种,是小麦遗传改良的重要基因资源。实验室前期研究中,发现簇毛麦4V染色体短臂(4VS)上携带有抗小麦黄花叶病、抗全蚀病等优异基因,并通过ph1b突变体诱导部分同源染色体配对和花粉辐射创制了涉及4V染色体的一系列结构变异体,对这些结构变异体的快速和精确鉴定将有助于外源基因的准确定位,覆盖全染色体、分布均匀的高密度外源染色体特异分子标记开发是外源染色体片段准确鉴定的基础。本研究在实验室选育了4VS染色体端体异附加系的基础上,利用流式细胞仪分拣出4VS染色体臂,利用高通量测序获得和拼接了4VS基因组组装序列。将拼接序列与已经公布的中国春4AL,4BS,4DS以及粗山羊草的4DS序列进行比对,发现存在大量的直系同源基因,证明它们之间良好的共线性关系。为开发4VS特异的高密度分子标记,筛选出包含内含子的直系同源基因,比较4VS和4AL,4BS和4DS同源基因内含子大小,选择4VS内含子大小分别都与中国春4AL,4BS,4DS对应内含子差异10%以上的序列,在簇毛麦该内含子前后相临近的两个外显子序列上分别设计PCR引物,开发跨内含子的分子标记,即内含子靶向的分子标记(Intron Targeted Marker,ITmarker)。本研究共设计359对引物,在中国春小麦(AABBDD)、簇毛麦(VV)、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(AABBVV)和小麦-簇毛麦易位系(T4DL·4VS)中扩增表明,232个为4VS特异的分子标记,多态率达64.62%,显著高于传统的外源染色体特异分子标记开发方法。更多还原