HBx激活调控LncRNA-HIAL参与肝细胞肝癌发病机制的研究

【作者】 胡姣姣； 仇雪梅； 宋伟； 吴华彰； 公丕海； 樊红；

【机构】 "发育与疾病相关基因"教育部重点实验室东南大学生命科学研究院； 东南大学医学院；

【摘要】 肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内严重危害人类生命和健康的疾病,是我国位居第二位的癌症"杀手"。在众多的致病因素中,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染居于首位。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)被认为是参与慢性乙型肝炎病理过程和诱发肝癌的最重要的蛋白质,但是其诱发肝癌发生的具体分子机制尚不十分清楚。长链非编码RNA(Long Non-coding RNA,LncRNA)不编码蛋白质却具有复杂的生物学功能,参与多种生物学进程包括肿瘤的发生发展。本研究意在探索HBx如何通过LncRNA介导HCC的发生。首先利用HBx稳转肝正常永生化细胞系LO2,高通量lncRNA芯片分析获得受HBx影响的lncRNA分子。生物信息学分析构建了lncRNA与mRNA间的共表达关系网络,再结合qPCR复正,筛选出一个HBx显著上调的分子NCRNA00178。进一步通过qPCR在临床肝癌组织中对其表达进行检测,其在肝癌临床病例中存在特殊的表达谱:其在正常肝组织不表达,但在肝细胞癌癌旁组织中表达水平明显升高,而肝细胞癌癌组织中该分子的表达水平相对于癌旁组织显著下降。提示NCRNA00178可能涉及到"炎-癌"转化过程,并且其表达水平与HBx存在正相关关系,命名为HBV相关肝癌炎癌转化相关lncRNA HIAL (HBV inflammation associated lncRNA)。进一步探究lncRNAHIAL功能及作用机制。该分子细胞模型的研究结果,表现为HIAL参与细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期进程,并能抑制周期相关抑癌基因P21、P27表达。在肝细胞及肝细胞癌细胞中HIAL过表达,发现其促进了细胞的增殖、抑制了细胞的凋亡,并促进细胞从G1期进入S期。P21、P27及CDK2是控制细胞突破G1/S期检验点的关键蛋白,我们通过western blot检测HIAL过表达及干扰后对这三种蛋白表达的影响,发现HIAL可以负调节P27蛋白的表达而促进CDK2蛋白的表达,并且能抑制P27 mRNA的表达。提示HIAL可能通过抑制P27表达影响细胞周期进程。已有研究报道,干扰EZH2或抑制其活性后P27表达水平显著增加。HIAL是否能够通过与EZH2结合招募PRC2复合物调节P27表达?我们通过RIP实验,在肝癌细胞中初步确定了HIAL与EZH2结合的可能性。NF-kB信号通路是一个在肝癌中研究非常广泛的炎症信号通路,HIAL的启动子预测到了NF-kB的结合位点,NF-kB是否可以调节HIAL的转录?使用NF-kB抑制剂PDTC及激活剂LPS刺激后,HIAL的表达变化不显著,NF-kB不能促进HIAL的转录。细胞炎症因子介导了炎症的发生,刺激炎症信号通路或者趋化免疫细胞对癌细胞的杀伤。而HBx可以促进IL-6,IL-8,IL-1β的表达,那么HIAL能否调节它们的表达?干扰HIAL后,IL-6,IL-8,IL-1βmRNA表达下调显著。本研究结果将有助于更加全面的理解HBx在诱发肝细胞癌中的调控机制,特别是对炎癌转化关键节点非编码RNA的调控。对于HBV慢性感染导致的肝细胞癌预防和治疗将可能提出新思路和切入点。更多还原