抗CD133人源性单克隆抗体的筛选、鉴定及表达

【作者】 夏静； 张莹； 张亚芬； 张建琼； 赵刚；

【机构】 东南大学医学院遗传与发育重点实验室； 东南大学附属中大医院；

【摘要】 CD133蛋白(prominin-1)属于五次跨膜蛋白—prominin家族,是该家族首个被鉴定的成员。Prominin家族蛋白的功能及其相应配体至今尚不清楚。目前已有大量研究表明CD133是多种人体肿瘤干细胞表面标志分子之一。CD133分子已经在人类多种恶性肿瘤中用于分离和富集细胞亚群,该细胞群体能在体外形成克隆,并能在动物体内形成肿瘤。最近研究表明CD133分子是有价值的细胞表面标志分子,有希望成为新治疗策略中的靶标。目前已有针对CD133分子的鼠源性单克隆抗体,但由于其鼠源性会产生人抗鼠抗体(HAMA),并且完整单抗分子过大难以进入肿瘤组织内,使其体内诊断及治疗受到了限制。因此,制备高特异性抗CD133的人源性单克隆抗体有重要意义。本研究通过原核表达并纯化CD133分子第二胞外片段(loop1)和第三胞外片段(loop2)蛋白。纯化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白经间接ELISA检测显示与鼠源抗CD133抗体发生特异性结合。以纯化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白作为靶分子,筛选TomlinsonI+J文库,获得人源性scFv噬菌体抗体。在筛选抗体库过程中,噬菌体种类、固相介质表面抗原密度或溶液中抗原浓度和清洗时间三个因素对筛选效率影响最大。因本次使用的sc Fv抗体库为无偏性的天然文库,所以采用了五轮筛选,前两轮采用中等的严密度,避免高亲和力但低表达的噬菌体抗体克隆丢失。后三轮的严格筛选达到了筛选目的。第五轮噬菌体的投入产出率比第三轮增加了42.5倍。将五轮筛选获得的多克隆噬菌体抗体均进行ELISA检测,发现五轮筛选的OD450nm吸光度值逐渐升高。以第五轮筛选后获得的多克隆噬菌体抗体感染宿主菌XL1-blue,挑取其中的单个菌落,制备出101株单克隆噬菌体抗体,用ELISA测定其抗原结合活性,以P/N值>2.1为阳性克隆,共计挑选87个阳性克隆,阳性率为86.1%。挑取其中6个P/N值>8的阳性克隆做进一步研究。以挑取的6株单克隆噬菌体抗体感染大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬菌粒,构建可溶性scFv表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mMIPTG诱导后收集菌体周质和包涵体蛋白。ELISA检测证实有1个克隆成功地表达了可溶性的scFv抗体蛋白,可溶性抗体与人CD133蛋白有特异结合活性。纯化后的scFv-1能够与鼠源CD133单抗发生相互竞争及抑制作用,说明其识别并结合的抗原表位一致或有一定程度的相互重叠。通过对克隆1的可变区进行序列测定分析与NCBI-BLAST检索,证实其与人免疫球蛋白Ig G重链VH3氨基酸同源性为93%,差异主要集中在CDR2、CDR3区,轻链V区与人免疫球蛋白Vκ1氨基酸同源性为97%,CDR1、CDR2、CDR3区均存在氨基酸差异。根据同一家族中核苷酸序列同源性大于80%,说明所获抗体基因重链属于人抗体VH3家族,轻链属于人抗体Vκ家族。本研究以噬菌体展示技术得到了人源性抗CD133的单克隆抗体并初步探索了该抗体的部分生物学特性,为进一步深入研究该人源抗体的生物学功能及应用前景等打下基础。更多还原