BAC-anchor：高通量BAC-end测序辅助基因组组装和物理图谱构建新方法

【作者】 杨晓慧； 杨煜； 凌建； 官建涛； 郭晓； 董道峰； 金黎平； 黄三文； 刘君； 李广存；

【机构】 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所； 中国农业科学院蔬菜花卉研究所； 中国农业科学院作物科学研究所；

【摘要】 【研究背景】目前已有众多作物的基因组相继完成,但仍存在组装不准确或组装错误问题,特别是同源多倍体作物的基因组组装和基因组分型依然是一个重要难题。细菌人工染色体(BAC)的大片段基因组承载能力,可以跨过几乎所有的重复序列,有效的将不同的contig连到一起,其BAC-end的成对测序辅助组装可大大提高基因组组装的准确性和效率。马铃薯是世界上第四大作物,但因其同源四倍体特性,其基因组的组装仍然存在一些困难。【材料与方法】基于四倍体马铃薯栽培种合作88(C88)BAC文库(平均插入片段90 kb),利用内切酶Cla I/Mlu I完全酶切,舍弃BAC克隆插入片段的中间序列,自连后转化大肠杆菌构建C88 BAC文库的BAC-end文库;利用Illumina HiSeq X10高通量测序获得BAC-end序列,将含有Cla I/Mlu I酶切位点的序列,利用Bowtie2与马铃薯单倍型参考基因组(DM)比对,鉴定酶切位点两侧序列在DM上的比对情况,统计比对位置间的距离(InterGap)。利用GATK鉴定SNP/InDel位点。Sanger法测序BAC-end单克隆和PCR产物验证BAC-endHiSeq序列的比对结果和SNP/InDel类型。【结果与分析】建立了高通量BAC-end测序辅助基因组组装和物理图谱构建新方法BAC-anchor,可以提供60-100 kb甚至200 kb的基因组片段,填补PacBio和Hi-C测序片段之间的Gap。BAC-anchor主要是将高通量测序获得的含有酶切位点的序列锚定到DM上,根据锚定的位置信息来评估基因组或指导基因组组装。该方法不同于传统Sanger法,可高效低成本的完成BAC-end测序和分析,极大促进了BAC末端序列的开发与利用。酶切位点两侧序列在DM上的比对分为3种类型:Matchsamechr reads(比对到同一条染色体)、Matchdifferentchr reads(比对到不同染色体或一端比对上而另一端比对到Gap上)和No matched reads(两端序列均比对不上)。本研究以马铃薯栽培种C88为例,利用该方法进行了验证。通过C88BAC-end文库测序与分析发现约有45.10%(ClaI)和27.2%(Mlu I)的reads唯一比对到DM上,其中属于Matchsamechr reads的比例分别为20.32%(Cla I)和10.16%(Mlu I)。Matchsamechr reads中,约有1/4的BAC-end reads含有60-100 kb InterGap(22.81%_Cla I、24.55%_Mlu I),可准确有效的比对到DM上,并得到了BAC-end单克隆Sanger法测序验证,大部分BAC-end序列不能很好地比对,预示着同源四倍体马铃薯基因组与DM基因组存在较大差异或马铃薯同源四倍体本身具有丰富的基因组结构变异。Matchsamechr reads可以对现有的DM基因组进行质量评估和分析;Matchdiffrentchr reads和No matched reads可用于contig/scaffold sequences的进一步组装和分型。【结论】本研究通过高效低成本的高通量BAC-end测序,突破传统Sanger法测定BAC文库末端序列费时费力的瓶颈,建立了BAC-end辅助基因组组装和物理图谱构建的新方法BAC-anchor,对于复杂基因组特别是同源多倍体基因组的高效准确组装具有重要意义。更多还原