花生全基因组SSR标记开发及应用

【作者】 鲁清； 洪彦彬； 李少雄； 刘浩； 李海芬； 刘海燕； 李杏瑜； 温世杰； 周桂元； 陈小平； 梁炫强；

【机构】 广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室；

【摘要】 【研究背景】微卫星（Microsatellites）或简单串联重复序列（Simple Sequence Repeats,SSR）在植物基因组中广泛分布。微卫星在不同位点或同一位点不同等位基因间的重复数和类型存在很大差异,但两端的序列多是保守的单拷贝序列,根据这一特性可开发SSR标记,用于遗传分析和分子育种。花生（Arachis hypogaea L.）是世界上重要的油料作物之一,其基因组属于异源四倍体（AABB,2N=4×40）,基因组大小在2.7 Gb左右。以往,花生基因信息组尚未解析,可供利用的参考信息较少,同时由于花生基因组的复杂性,遗传标记开发难度大,使得农艺性状的遗传分析及分子育种应用相对滞后。如今花生野生种和栽培种基因组DeNovo测序的完成,为花生全基因组标记的开发,高密度物理图谱的构建提供了可能。【材料方法】前期,我们对一个花生四倍体栽培种"伏花生"进行了De Novo测序。基于该参考基因组,利用MISA对全基因组的SSR进行搜索,以获得的SSR保守的侧翼序列,利用Primer 3进行SSR标记的设计。利用e-PCR对设计的SSR marker进行生物信息学评估;同时,随机挑选了188对SSR标记,进行了PCR扩增验证。通过对先前已开发的SSR标记与本研究开发的标记进行整合,获得一张高密度SSR标记物理图谱。最后,利用该图谱对先前定位的花生晚斑病QTL进行标记加密和物理定位。【结果与分析】本研究共搜索到8329496个SSRs,其中A和B亚基因组分别有3772653和4414961个SSRs,还有141882个SSRs位于9个scaffolds上。通过SSRs侧翼序列,共开发了973984对SSR标记,密度达到392.45/Mb。其中,在A、B亚基因组和scaffolds上分别有462267、489394和22323对标记。利用e-PCR进行生物信息学评估表明有88.32%的SSR标记在两个栽培种基因组上仅能扩增出一个产物,显示了良好的特异性。通过对随机挑选的188对SSR标记进行了实际的PCR扩增验证,结果显示有44.15%的标记能获得目的产物。进一步对1276对已发表的SSR标记与本研究开发的标记进行整合,获得了一张超高密度花生栽培种SSR物理图谱。最后,利用该图谱上的标记对已定位的花生晚斑病QTL,q LLS_T13_A05₇,进行标记加密,共增加了819个新开发的SSR标记,并将该QTL物理定位到A05染色体的1.448Mb区间内,预测到了108个候选基因。【结论】本研究构建的花生超高密度SSR物理图谱可为花生重要农艺性状的遗传解析提供大量的可用标记,有助于加速花生分子育种进程。更多还原