IbC3H18提高甘薯抗逆性的分子机制研究

【作者】 张欢； 翟红； 高少培； 赵宁； 刘庆昌； 何绍贞；

【机构】 中国农业大学；

【摘要】 【研究背景】甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源块根作物,在世界粮食生产中占第七位。中国是世界上最大的甘薯生产国,年产量7079.37万吨,占世界总产量的67.30%(FAO,2016)。我国盐碱地、干旱、半干旱地区面积广阔,而甘薯较耐旱、耐低度盐碱、耐瘠薄,加强对甘薯抗逆性的研究,对国家的生态环境建设、粮食安全和生物质能源发展意义重大。甘薯种间、种内杂交不亲和,许多品种开花困难,种质资源较匮乏,常规育种受到严重制约。运用基因工程技术能够克服常规育种中存在的生殖隔离和基因连锁等障碍,对甘薯的耐盐抗旱性进行定向改良。【材料与方法】本研究以耐盐甘薯品系ND98为材料,利用RACE技术从ND98中克隆得到编码非串联型CCCH锌指蛋白的IbC3H18基因。利用根癌农杆菌介导法,分别在ND98中进行Ib C3H18基因的过表达和干扰,获得转基因植株,对转基因植株的抗逆性进行鉴定,并解析Ib C3H18调控耐盐抗旱性的分子机制。【结果与分析】Ib C3H18基因组全长2749bp,包含7个外显子和6个内含子,cDNA全长为2219bp,ORF为1698bp。IbC3H18编码的氨基酸序列包含1个"C-X7-C-X5-C-X3-H"型(CHYFSKGFCKHGSNCRYLH)zinc finger CCCH结构域和1个RNArecognitionmotif(RRM)保守结构域。IbC3H18基因与拟南芥中的AtC3H18基因亲缘关系最为接近。IbC3H18的启动子序列包含一些非生物胁迫相关的应答元件。将3171bp的Ib C3H18启动子序列进行5’端缺失截短获得七个片段,分别融合GUS报告基因获得稳定转化的烟草植株,七个截短片段在根茎叶各组织中均具有启动活性,其中1149 bp的pro D3片段显著被NaCl和ABA诱导。Ib C3H18基因在甘薯茎中表达量最高,在抗逆品系ND98中可快速响应NaCl、PEG6000、H2O2和ABA胁迫。亚细胞定位及转录激活实验表明IbC3H18是一个核定位的转录激活因子。抗性鉴定结果表明过表达Ib C3H18能够显著增强转基因甘薯植株的耐盐、抗旱及抗氧化性,而RNAi沉默植株的抗性显著降低。RNA-seq差异基因富集结果及生理生化指标测定结果表明,过表达Ib C3H18通过激活ROS清除系统和ABA信号途径,增加光合活性,维持离子渗透平衡来提高甘薯的抗逆性。ChIP-seq分析结果表明,转录激活因子IbC3H18能够结合在氧清除相关基因CCS、ABA受体基因PYL8及抗逆相关基因SOS5的启动子上激活这些基因的表达。此外,酵母双杂、LCI、BiFC和Co-IP结果证明Ib C3H18与病程相关蛋白Ib PR5互作。过表达IbPR5能够通过激活ROS清除系统提高转基因烟草植株的抗逆性。【结论】逆境胁迫诱导的转录激活因子IbC3H18与抗逆相关病程相关蛋白Ib PR5互作,并且通过结合在氧清除相关基因CCS、ABA受体基因PYL8及抗逆相关基因SOS5的启动子上激活这些基因的表达。过表达IbC3H18基因能够通过激活ROS清除系统和ABA信号途径,增加光合活性,维持离子渗透平衡来提高甘薯的抗逆性。更多还原