补肾舒脊颗粒对人骨髓间充质干细胞成骨分化后Wnt5a、β-catenin、BMP4、Smad4表达的影响

【作者】 鄢泽然； 史光耀； 王晓曈； 张岚； 陈路； 赵超群； 白雯； 阎小萍；

【机构】 中日医院； 内蒙古医科大学； 航空总医院； 北京中医药大学第三附属医院； 北京市丰台区中西医结合医院；

【摘要】 目的:异位骨化是强直性脊柱炎(AS)后期的主要病理特点,其机制可能与Wnt和BMP通路介导的间充质干细胞(BMSCs)软骨内成骨及膜内成骨有关。前期临床基础研究显示补肾舒脊颗粒能调节患者血清中Wnt和BMP通路上游因子DKK1和BMPs的水平,故补肾舒脊颗粒治疗AS延缓异位骨化的可能机制是调节Wnt和BMP信号通路细胞因子的表达。本研究拟探索BMSCs向成骨细胞分化过程中,补肾舒脊颗粒调节Wnt和BMP信号通路的作用和关键靶点。方法:复苏培养人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)至第3代,给予诱导培养使其向成骨细胞分化,待分化完成后将细胞分为6组:空白组、模型组、对照组及中药高、中、低剂量组。空白组加入基础培养基(3.8ml)+5%正常大鼠血清共同培养(0.2ml):模型组加入成骨诱导培养基(4.8ml)+5%正常大鼠血清(0.2ml)共同培养;对照组加入成骨诱导培养基(3.8ml)+5%洛索洛芬钠大鼠含药血清(0.2ml);中药高、中、低剂量组分别加入成骨诱导培养基(3.8ml)+5%补肾舒脊颗粒大鼠含药血清(0.2ml)共同培养。28天后提取各组细胞的总RNA和总蛋白,通过逆转录-实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot),比较各组细胞Wnt5a、β-catenin、BMP4、Smad4 mRNA及蛋白表达的差异,探索补肾舒脊颗粒含药血清对Wnt和BMP信号通路关键细胞因子表达的影响。结果:1.与模型组比较,对照组和中药各剂量组Wnt5a、β-catenin、BMP-4 mRNA表达降低(P<0.05或P<0.01);中药高剂量组Smad-4 mRNA表达水平降低(P<0.05)。2.与对照组比较,中药高剂量组Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4 mRNA水平均降低(P<0.05)。3.与中药低剂量组比较,中药高剂量组Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4 mRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。4.与模型组比较,对照组、中药低、中剂量组Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4蛋白表达均降低(P<0.05)。5.与对照组比较,中药中剂量组Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4蛋白表达水平降低(P<0.05)。6.与中药低剂量组比较,中药中剂量组Wnt5a蛋白表达降低。结论:1.补肾舒脊颗粒含药血清高剂量可下调BMSCs分化后成骨细胞Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4 mRNA的表达,与低剂量组比较差异具有统计学意义,可见补肾舒脊颗粒与上述靶点mRNA的表达具有一定的量效关系。2.补肾舒脊颗粒含药血清中、低剂量可下调Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4蛋白表达水平,中低剂量组间差异不具有统计学差异,量效关系不显著。3.补肾舒脊颗粒通过抑制Wnt5a、β-catenin、BMP-4、Smad-4 mRNA和蛋白的表达,调控成骨细胞Wnt和BMP通路,从而起到延缓强直性脊柱炎异位骨化的作用。补肾舒脊颗粒与上述细胞因子表达间的量效关系还需进一步探索。更多还原