miR-218-5p靶向调控SFRP2对家兔毛囊发育的影响

【作者】 赵博昊； 陈阳； 胡帅帅； 穆琳； 杨乃苏； 王曼曼； 吴信生；

【机构】 扬州大学动物科学与技术学院；

【摘要】 本试验通过构建皖系长毛兔毛囊发育剪毛模型,探究miR-218-5p通过靶向SFRP2对长毛兔毛长发育的影响,以期进一步阐明家兔毛囊发育的分子调控机制,并且为家兔毛长性状的育种工作提供帮助。试验选取80日龄的皖系长毛兔进行剪毛处理,每10天测定背部毛干生长长度,采集皮肤样本。通过组织切片进行毛囊的形态学观察,qRT-PCR检测毛囊周期相关基因表达量,判定毛囊周期。合成SFRP2的siRNA并构建pcDNA3.1过表达质粒,进行干扰和过表达实验,检测Wnt信号通路和毛囊发育相关基因表达量,验证SFRP2在Wnt信号通路中的作用。结合本课题组前期对毛长相关miRNA的筛选,发现miR-218-5p参与家兔毛囊发育的过程,同时预测发现SFRP2为miR-218-5p的靶基因,并通过荧光素酶报告基因检测系统和定点突变技术,验证miR-218-5p与SFRP2的靶向关系。利用TOP/FOP荧光素酶报告系统检测miR-218-5p和SFRP2对Wnt信号通路的激活水平,探究miR-218-5p靶向调控SFRP2通过Wnt信号通路对家兔毛囊发育的影响。结果表明:实验兔毛干的增长速度在剪毛后10-1 10d显著高于其它时期;120-160d毛干生长速度逐渐减慢,定量结果显示SFRP2在140-1 60d表达显著上调(P<0.05),结合毛囊组织切片判定此时期为退行期。利用RNAi技术,敲低SFRP2导致Wnt信号通路下游基因的表达水平显著上调(P<0.05),而过表达SFRP2则对Wnt信号通路下游关键基因起到显著的抑制作用(P<0.05)。通过生物信息学分析,发现miR-218-5p与SFRP2的3’UTR存在结合位点。转染miR-218-5p模拟物和抑制物至RAB-9细胞,发现miR-218-5p模拟物能够显著下调SFRP2基因的表达(P<0.05)。利用3’RACE技术对长毛兔SFRP2 3,UTR片段进行扩增,构建荧光素酶报告野生型和突变型载体,结果发现仅共转染野生型载体和miR-218-5p模拟物能够显著下调荧光素酶活性(P<0.05),证实miR-218-5p靶向调控SFRP2。TOP/FOP荧光素酶报告基因结果显示SFRP2下调了Wnt信号通路的激活水平,而miR-218-5p能够激活Wnt信号通路的转录调控。说明miR-218-5p通过靶向SFRP2影响家兔毛囊发育。结论:通过RNA干扰和过表达技术,发现SFRP2基因作为Wnt信号通路的上游基因,可抑制Wnt信号通路的表达调控,进一步实验验证了miR-218-5p与SFRP2的靶向关系。由此可知,miR-218-5p能够靶向抑制SFRP2的表达,通过Wnt信号通路影响毛囊发育。更多还原