深海真菌埃德菌FS110的基因组测序及胶霉毒素生物合成机制分析

【作者】 叶伟； 黄自磊； 刘桃妹； 朱牧孜； 李赛妮； 刘帅； 孔亚丽； 李浩华； 许丽琼； 章卫民；

【机构】 广东省微生物研究所省部共建华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室；

【摘要】 胶霉毒素是一种具有广谱抑菌、抑病毒、抗氧化、强抗肿瘤活性和免疫调节活性的毒素,由胶霉毒素制备的杀菌剂和杀虫剂对防治水稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病有很好的防治效果。胶霉毒素在治疗肝纤维化方面已经有应用,胶霉毒素类似物应用小细胞肺癌已经进入临床III期,证明胶霉毒素在生物医药领域有很好的应用前景。本课题组组前期在深海真菌埃德菌FS110的代谢产物中分离纯化得到了大量结构新颖的胶霉毒素及其衍生物,分离得到的胶霉毒素对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性。在此基础上对埃德菌FS110进行了全基因组测序,本项目组对深海真菌D. cejpii进行全基因组测序。测序结果表明,所得碱基数为40,830,384,909 bp, Q20为98.87%,所得数据的测序单分子clean数据序列的长度分布统计如下图所示,说明本次测序质量较高,可用于后续分析,所得基因组大小为24.32M。GC含量为49.697%。FS110基因组共预测得到8550个基因。从FS110基因组结果中共获得88个与胶霉毒素生物合成相关的基因。预测Cluster18为胶霉毒素生物合成基因簇,与二酮哌嗪类化合物Aspirochlorine生物合成基因簇的相似度为13%。为了更好地解析FS110中胶霉毒素生物合成转录调控机制,并对其生物合成基因进行更好的异源表达,对其中胶霉毒素的生物合成基因启动子功能进行了分析。通过3-4次巢式PCR反应,筛选阳性克隆,获得gliG/gliI/gliO三个基因的启动子片段G1、G2、I1、I2、O1、O2并测序成功。寻找启动子核心区域,然后扩增出gliG/gliI/gliO三个功能基因的上游包括核心启动子区域200-700bp左右片段,如gliG基因上游500bp,gliI基因上游700 bp,gliO基因上游300 bp。萤火虫荧光素酶检测试剂得出,gliG核心启动子区域具有较高的转录活性。将启动子插入pGL3-basic载体中,将0.5 kb gliG核心启动子区域替换pGPDA启动子,将2μ-pAN7-1-gliG核心启动子载体以及2μ-pAN7-1载体(阳性对照)分别电转入酿酒酵母,含有2μ-pAN7-1-gliG核心启动子载体的酵母生长较快,而且菌落数较多。为了对胶霉毒素的生物合成基因进行基因编辑,我们成功构建了适用于海洋真菌FS110的PFC332-sgRNA载体和PX459-sgRNA-GFP-Ble载体。其中PFC332-sgRNA载体中加入了在酵母细胞中发挥作用的sg RNA靶向序列骨架基因;在PX459-sgRNA-GFP-Ble中加上了sg RNA靶向序列以及博来霉素抗性Marker,为后续突变菌株的筛选提供了更加可靠的筛选标记。gliG、gliI、gliO靶向序列的PFC332-sgRNA质粒成功导入到D. cejpii原生质体中,并且筛选出阳性克隆,利用潮霉素抗性基因引物克隆,得到gliG阳性克隆2个,gliO阳性克隆1个,并通过验证了目的基因gliG、gliO的成功敲除。本研究关于深海真菌FS110的基因组测序及胶霉毒素生物合成基因及其启动子的分析为FS110中胶霉毒素生物合成途径的阐明奠定了分子生物学基础。更多还原