根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌T-DNA插入突变研究

【作者】 贺丹； 冯泽庆； 王丽；

【机构】 吉林大学基础医学院病原生物学系；

【摘要】 镰刀菌感染严重危害人类健康,特别是播散性感染病死率极高。该菌是天然多重耐药真菌,几乎对所有临床抗真菌药物均具有耐药性。因此解析其致病和耐药机制至关重要。本研究建立并优化了根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系,获得了1450株T-DNA插入突变体,并筛选获得了1株药物敏感性改变的突变体FOM1123,其对酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑及泊沙康唑敏感性均明显增强。利用TAIL-PCR获得了该突变体的T-DNA插入位点侧翼序列,生物信息学分析表明假定蛋白基因(HPG)和NADPH-细胞色素P450还原酶基因(CPR1)被打断。分别构建基因敲除株ΔCPR1和ΔHPG,分析发现仅ΔCPR1的药物敏感性增强,表明CPR1基因与尖孢镰刀菌耐药性相关。有研究表明,CPR和细胞色素b5均可为甾醇合成关键酶CYP51提供电子。转录水平分析结果显示,当CPR1表达缺失时,其同源基因CPR2及cyt b5、CYP51A、CYP51B表达均上调,而同源基因CPR3、CPR4表达未见明显变化。对CPR1的同源基因进行敲除,发现3个同源基因与唑类耐药无关。麦角甾醇含量分析显示,与野生株相比ΔCPR1的麦角甾醇含量降低。表明CPR1是尖孢镰刀菌麦角甾醇合成通路中的关键基因,CPR同源基因中仅有CPR1与唑类耐药相关。上述结果可为寻找新型抗真菌药物靶标、揭示真菌耐药机制奠定基础,亦可为其他真菌相关研究提供参考。更多还原