HPLC法制备高纯度桦褐孔菌醇的研究

【作者】 部丽丽； 冯慧琴； 舒丽雯； 陈偲； 杨晓彤；

【机构】 上海师范大学生命与环境科学学院； 上海芝草生物技术有限公司；

【摘要】 桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又称白桦茸,主要分布于东欧、俄罗斯和北美的部分地区,我国黑龙江、吉林省(长白山)等地也有分布。该菌菌核在东欧及俄罗斯民间传统上用于癌症、心脏病及糖尿病等的治疗。桦褐孔菌醇(Inotodiol)是该菌的主要活性成分之一。这是一种羊毛脂烷型的三萜类化合物,现代药理学研究发现其在体外可抑制甚至杀死胃、肺、乳腺、直肠癌及霍金斯淋巴瘤等多种癌细胞,并在动物实验中显示出显著的抑制移植瘤的活性,因此具有开发成抗肿瘤药物的前景。然而目前市场上尚无商品化的高纯度产品提供,这不仅限制了进一步的药理和药效学研究,也使得对桦褐孔菌产品质量进行分析和监控时因缺乏参照品而难以进行。本研究采用可符合制药工艺要求的制备HPLC法获取高纯度的桦褐孔菌醇,克服了传统的硅胶柱层析法效率低、污染和毒性大、且获得的制品纯度不高等缺点,获得的高纯度桦褐孔菌醇可为深入研究其抗肿瘤的作用和机制提供物质基础,并可作为相关产品质量分析和检测的可靠参照物。样品制备前处理以菌核为材料,用乙醇常温渗漉、乙酸乙酯萃取,用硅胶柱去除强极性杂质,用Extract-clean SPE C18柱层析去除强非极性杂质,得到含桦褐孔菌醇的精制品,纯度约为15%,以此作为HPLC制备的原料。采用Varian Prostar218制备型高效液相色谱仪,先用分析型色谱柱(Hypersil GOLD, 250×4.6mm,5μm)优化条件,改变流速(0.6-1.0ml/min)和进样体积(20-1100μl),紫外波长210nm检测,分析桦褐孔菌醇峰与杂质峰的分离度。结果显示流速为0.8ml/min、进样体积为100μl时分离度最佳,以此条件按柱径和柱长进行线性放大,在制备色谱柱上(SinoChrom ODS-BP,300mm×40.0mm, 15μm)进行放大制备,流速为32ml/min,进样量8ml,收集含桦褐孔菌醇的馏分。该馏分用HPLC分析柱分析纯度,用蒸发光散射检测器检测(漂移管温度32℃,氮气流量0.5ml/min),发现纯度为57.09%,对该馏分再次用制备HPLC分离,最后得到纯度为97%的桦褐孔菌醇分离物,得率相对菌核为0.04%。获得的分离物用1H-NMR、13C-NMR、低分辨和高分辨率ESI质谱进行了结构确认。Agilent 1100 LC/MSD SL低分辨ESI-MS测得该分离物的分子离子峰m/z为425.4[M+H-H2O]、407.4[M+H-2H2O]和443.3 [M+H];Thermo Fisher Scientific LTQ FTICR ESI-HRMS(DART Positive mode)分析m/z为425.4的分子离子峰,得到的m/z为425.3772 [M+H-H2O],计算后分子式为C30H49O,推算出的分子式为C30H50O2,因此分子量与分子式均与桦褐孔菌醇一致。1H-NMR(500MHZ CDCl3)在高场区可见四环三萜类化合物典型的五个角甲基尖峰δ0.75(3H, s)、0.81 (3H, s)、 0.87(3H, s)、 0.98(3H, s)和1.00 (3H, s),13C-NMR (500MHZ CDCl3)、DEPT和COSY结果显示的碳原子数与位置也均与桦褐孔菌醇的结构完全相符,因此确认制备得到的为高纯度桦褐孔菌醇。更多还原