平菇6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆、表达及酶学特性研究

【作者】 雷敏； 邬向丽； 张金霞； 王贺祥； 黄晨阳；

【机构】 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业部微生物资源收集与保藏重点实验室； 中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室；

【摘要】 6-磷酸海藻糖合成酶(EC2.4.1.15)催化尿苷二磷酸葡萄糖与6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖,该反应为海藻糖合成的第一步反应。为了确定平菇中该酶的基因及酶动力学参数,本研究将平菇中6-磷酸海藻糖合成酶基因进行了克隆测序,得到一段1665 bp的开放阅读框,该序列编码一个554个氨基酸的蛋白质,预测分子大小为62.01 k Da。将该基因在大肠杆菌BL21菌株中进行表达,并将异源表达蛋白进行纯化及特性分析。结果表明:该异源表达蛋白的最适p H为7.4,最适温度为30℃;6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖的Km值分别为0.14和0.17 mM;Vmax和Kcat值分别为91.86 nkat/g和5.89 s-1。平菇菌丝在40℃热处理15 h后海藻糖的含量达到最高值,即158.88 mg/g干重,这与该时间点6-磷酸海藻糖合成酶的酶活最高相一致。这些结果表明克隆得到的6-磷酸海藻糖合成酶在平菇中参与了海藻糖的合成。更多还原