眼镜蛇毒细胞毒素-1选择性抑制HSC-LX2细胞的研究

【作者】 张学荣； 王秀男； 廖明； 宋天麟； 农君； 陶慧娟； 陈荣芳；

【机构】 广西医科大学蛇毒研究所； 广西医科大学生命科学研究院；

【摘要】 目的通过层析法从眼镜蛇毒中分离高纯度高生物活性细胞毒素-1 (CTX-1),以人肝正常细胞(HL7702)为对照探索CTX-1对人肝星状细胞(HSC-LX2)的选择性抑制作用及其作用机制。方法依次应用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Spehadex G-50凝胶层析和Macro-prep HighS阳离子交换层析来对眼镜蛇毒进行分离纯化以获得CTX-1。以人肝正常细胞(HL7702)为对照,采用CCK-8法检测CTX-1对HSC-LX2细胞增殖的影响;采用流式细胞技术检测CTX-1对HSC-LX2细胞周期分布的影响与CTX-1诱导HSC-LX2细胞凋亡的作用;采用透射电镜观察CTX-1对HSC-LX2细胞超微结构的影响;采用Western Blot检测CTX-1作用于HSC-LX2细胞不同时间后AKT信号通路中AKT和p-AKT蛋白表达量的变化,及CTX-1和PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对HSC-LX2细胞中Akt蛋白磷酸化水平的影响。结果眼镜蛇毒粗毒冻干粉经三步层析,分离纯化获得电泳纯的CTX-1,分子量为9.498KDa。CTX-1对两种细胞的增殖有抑制作用,呈剂量依赖性,CTX-1抑制HSC-LX2细胞增殖的IC50为2.50μg/ml;抑制HL7702细胞增殖的IC50达到18.97μg/ml。不同浓度CTX-1干预LX2细胞24h后,随着药物浓度增加,S期百分比升高,G1、G2期百分比均下降,细胞阻滞于S期。CTX-1诱导HSC-LX2凋亡的最小有效浓度为2μg/ml;诱导HL7702凋亡的最小有效浓度为4μg/ml。通过透射电镜可见,空白对照组中的LX2细胞形态结构正常,无明显凋亡表现;CTX-1干预组细胞数量减少,可见胞质空泡化,染色质凝聚、边集,细胞核裂解,出现凋亡小体等细胞凋亡的特征性形态学改变。CTX-1作用于LX2细胞不同时间后,AKT蛋白表达量没有显著差异,p-AKT蛋白的表达量随作用时间的延长而减少。CTX-1和抑制剂LY294002都可以抑制磷酸化Akt蛋白的表达量,两者联用效果最佳。结论与HL7702相比CTX-1对HSCLX2的细胞毒性更强,具有选择性抑制作用,增殖抑制作用呈剂量依赖性。CTX-1可能是通过使细胞阻滞在S期而影响细胞增殖。CTX-1对HSC-LX2细胞有更强的诱导凋亡作用,并可抑制Akt信号通路中p-AKT的表达,说明CTX-1可能通过抑制AKT信号通路的激活而促进细胞凋亡。更多还原