山豆根主要成分苦参碱诱导人正常肝细胞L-02凋亡及其对细胞周期和细胞能量代谢的影响

【作者】 耿娅； 王清然； 邵珍； 邓中平；

【机构】 上海中医药大学药物安全评价研究中心；

【摘要】 目的:探索山豆根及主要成分苦参碱诱导人肝(实质)细胞L-02凋亡的作用及其对细胞周期和细胞代谢的影响。方法:以人肝细胞株L-02为模型,采用CCK-8法测定药物对细胞增殖的影响,采用FITC Annexin V/PI双染法在流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响,采用PI/RNase法在流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响,采用线粒体压力及糖酵解压力测试方法在Seahorse XF细胞外流量分析仪检测药物对细胞糖代谢及有氧呼吸的影响,系统比较山豆根及苦参碱(山豆根水提物含5%左右的苦参碱)在不同时间与浓度对人正常细胞L-02的增殖的影响以及15hr对L-02细胞凋亡、细胞周期及细胞代谢的影响。结果:(1)山豆根水提物及苦参碱均抑制L-02细胞增殖,具有毒时关系及量效关系,IC50分别为10.95mg/mL、2.19mg/mL。(2)二者均能诱导L-02细胞的凋亡,与细胞共孵育15h后,和空白对照组相比,山豆根水提物12、18 mg/mL组以诱导早期凋亡为主,凋亡比例分别为13.62%,14.89%;而20mg/mL组细胞则主要表现为晚期凋亡,凋亡比例为20.52%;苦参碱在浓度为1、1.33 mg/mL没有明显凋亡,1.67、2 mg/mL早期凋亡比例分别为17.27%和32.83%。(3)山豆根在浓度8、12、18和20 mg/mL时,G2/M期细胞的比例分别为17.3%,31.6%,23.40%和18.89%,明显高于对照组(8.6%,p<0.05),提示G2/M期阻滞。同时随着山豆根的浓度增加,细胞S期延长(S期细胞比例分别为10.76%,15.77%,23.49%,27.11%,对照组为14.87%)。苦参碱浓度为1、1.33、1.67mg/mL时G0/G1期细胞约85%,明显高于对照组(76%, p<0.05),提示低浓度的苦参碱导致G0/G1期阻滞。高浓度2mg/mL时, G2/M期细胞比例25.43%, S期21.14%,明显高于对照组(8.6%、14.87%),提示高浓度苦参碱可导致G2/M期阻滞,S期延长。(4)苦参碱各浓度和高浓度山豆根(18和20 mg/mL)处理L-02细胞后,对细胞糖代谢的能力和有氧呼吸产生影响,具体来说,山豆根和苦参碱能够抑制L-02细胞的有氧呼吸和糖酵解过程,而且随着药物浓度的增加,抑制效果更明显,进而产生细胞毒性影响细胞整体的生长状态。结论:山豆根及苦参碱均能对人肝细胞L-02产生毒性,通过诱导细胞凋亡和阻滞生长周期来抑制细胞生长,其诱导凋亡的机制可能和影响了线粒体的能量代谢有关。与L-02细胞孵育15h,山豆根及苦参碱的IC50分别为10.50mg/mL,2.19mg/mL。对应浓度下,山豆根对L-02细胞的毒性作用似强于苦参碱。更多还原