SiO₂致RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接的影响

【作者】 薄存香； 张玉； 贾强； 赛林霖； 邵华； 杜忠君；

【机构】 山东省职业卫生与职业病防治研究院；

【摘要】 目的:探讨Si O2对RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的影响。方法:采用CCK-8检测细胞的存活率。取对数生长期的细胞接种于96孔板,调整细胞密度为5×104个/孔。培养24小时后,加入含不同浓度Si O2(0,25,50,100,150ug/ml)的DMEM培养液200ul/孔,培养24小时后,加入CCK-8试剂,酶标仪检测450nm处各孔OD值,每组设3个复孔,重复3次。细胞GJIC功能测定采用划痕标记染料示踪技术(SLDT)。将细胞接种于直径35mm的培养皿中,细胞长成融合单层后换入含不同浓度Si O2(0,25,50,100ug/ml)DEME培养液。染毒6h后,以37℃的0. 1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗细胞3次,加入预温的质量浓度为0. 05%的LY 2 ml,用锋利的手术刀片轻划细胞层,标记3分钟,吸出LY,用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次,加入pH 7. 0磷酸盐缓冲甲醛液固定,显微镜下观察荧光传递情况。每个浓度组设3个平行皿,每皿平行划痕5次,选择划痕较平滑处计数带有荧光的细胞层数。荧光局限于划痕边缘的单层细胞判为未传递(-),1～2层细胞有荧光为(+),2～3层细胞有荧光为(++),3～4层细胞有荧光为(+++),4～5层细胞有荧光为(++++),5层以上细胞有荧光为(+++++)。将每处划痕的观察结果(-)～(+++++)量化为0～5,然后计算各组16～20处划痕的平均值。采用Annexin V/PI双标记法流式细胞术检测细胞凋亡率,设Si O2 0,25,50,100ug/ml浓度组,每组设3个平行。用不含EDTA的胰酶消化细胞,离心收集细胞。PBS洗涤细胞2次,离心收集细胞,加入Annexin V-FITC、PI染液各5ul混匀,室温避光反应15min。再加入400ul的BindingBuffer混匀,用流式细胞仪检测。所有数据采用SPSS 16.0进行统计分析。结果:细胞存活率随Si O2浓度增高而降低,100,150ug/ml(分别为92.47±1.46,80.63±1.72,%)浓度组细胞存活率显著低于对照组(100.13±0.51,%),差异有统计学差异(P<0.05)。LY荧光染料沿划痕边缘垂直扩散的距离随处理浓度的增加而缩短,50,100ug/ml(分别为2.28±1.07,1.63±0.89)浓度组与对照组(3.00±1.03)比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡率随着染毒剂量的增高而增高,25, 50, 100ug/m (分别为2.18±0.14, 2.67±0.21, 3.82±0.30,%)均高于对照组(1.71±0.12,%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Si O2通过破坏RLE-6TN肺泡上皮细胞缝隙连接促进细胞凋亡更多还原