锰干扰SNARE复合物介导的囊泡融合的分子机制

【作者】 王璨； 马卓； 闫冬莹； 刘畅； 邓宇； 刘巍； 徐兆发； 徐斌；

【机构】 中国医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室；

【摘要】 目的锰是人体必需微量元素之一,参与体内重要的代谢过程,但环境中的锰过量蓄积于脑内则会干扰突触囊泡融合,影响神经递质释放,进而导致神经毒性。我们前期研究发现锰可以通过影响SNARE复合物（soluble NSF accessory protein receptor）核心蛋白SNAP-25和VAMP-2的表达,从而干扰SNARE复合物形成。为了探寻其机制,本研究应用SH-SY5Y细胞建立体外模型,用钙蛋白酶抑制剂——calpeptin抑制钙蛋白酶（calpain）活性,利用shRNA干扰技术,抑制α-Syn表达,进一步探讨SNAP-25裂解及α-Syn过表达在锰干扰SNARE复合物形成中的作用,为锰致神经毒性机制的研究提供实验依据。方法实验分为8个剂量组,分别为对照组,100μM锰处理组,4μM calpeptin对照组,4μM calpeptin+100μM锰预处理组,shRNA转染组,shRNA转染+100μM锰处理组,错译shRNA转染组,错译shRNA转染+100μM锰处理组。观察细胞活力及培养液中LDH的释放量,测定细胞内Ca²⁺浓度及calpain活性,测定SNARE复合物相关蛋白的基因及蛋白表达,检测α-Syn与VAMP-2及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用,以及活动性突触囊泡的释放。结果锰处理组LDH释放量,细胞凋亡率,α-Syn及VAMP-2的mRNA和蛋白表达均升高,SNAP-25蛋白表达下降并出现N端裂解碎片,并且使α-Syn与VAMP-2之间的相互作用增强,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用减弱,FM1-43标记的突触囊泡释放减少。4μM calpeptin+100μM锰处理组预处理组SNAP-25蛋白表达明显增加,且碎片消失,突触囊泡释放增多。shRNA干扰α-Syn表达模型,可以有效的降低α-Syn mRNA和蛋白的表达达到80%以上。用100μM锰分别处理α-Syn抑制细胞和正常细胞发现,细胞损伤程度明显下降,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用也减弱,突触囊泡释放增多。4μM calpeptin单纯处理组及携带错译shRNA慢病毒的细胞对各项指标没有影响。结论锰诱导calpain活化可裂解SNAP-25,α-Syn过表达会与VAMP-2结合增多,影响SNARE复合物的形成,从而导致囊泡释放紊乱。更多还原