饲用高粱褐色中脉bmr-6及其相关基因研究进展

【作者】 詹秋文； 李杰勤； 王丽华； 刘言龙；

【机构】 安徽科技学院农学院；

【摘要】 高粱褐色中脉与传统白脉品种相比,其可消化纤维素和半纤维素含量增加,难以消化的木质素含量显著降低,利用褐色中脉突变体来改善饲用高粱及高粱-苏丹草杂交种品质已引起各国研究者的浓厚兴趣。本研究鉴定了一个高粱bmr-6(brown midrib-6)突变体,其中脉和茎杆为红褐色。相比于野生型,bmr-6突变体的Kalson木质素含量显著降低。中脉组织切片分析表明突变体的木质素含量降低,但组织中多糖含量增加。利用图位克隆的方法克隆了bmr-6基因,它编码了木质素合成途径上的肉桂醇脱氢酶基因(CAD)。荧光定量PCR分析表明,BMR-6基因在各组织都有表达,但在茎和中脉表达最高。亚细胞定位分析表明BMR-6蛋白在细胞质中行使功能。遗传互补分析表明,CAD能互补bmr-6表型。单个CAD基因的缺失往往能够被CAD基因家族其它成员弥补,因而限制了其在分子育种中的应用。这就需要解析参与木质素合成途径上的多个CAD基因的功能。通过时空表达分析表明,BMR-6、SbCAD-3和SbCAD-4都可能参与到高粱木质素单体的生物合成,SbCAD-4基因的表达模式与BMR-6相似,即在茎中的表达量最高,而SbCAD-3基因在各检测的组织中表达无明显差别。亚细胞定位分析表明这3个蛋白皆在细胞质中执行其功能。原核表达的酶活分析表明,BMR-6对肉桂醇和香豆醇的亲和性最强,而SbCAD-3则表现出对香豆醇和松柏醇较高的亲和性,SbCAD-4对肉桂醇有较高的亲和性。从Vmax/Km比值来看,bmr-6相比于SbCAD-4和SbCAD-3蛋白来说有更强的酶活性,SbCAD-4比SbCAD-3有更强的酶活性。这表明BMR-6应该在木质素单体合成过程中起主要作用。进一步测定了野生型、bmr-6突变体、RNAi-SbCAD-3和RNAi-SbCAD-4转基因植株T2代的Kalson木质素,发现相比于野生型,bmr-6突变体和RNAi-SbCAD-4转基因植株中的木质素含量明显降低,而RNAi-SbCAD-3转基因植株中Kalson木质素含量与野生型无显著差异,这表明BMR-6和SbCAD-4基因参与了高粱木质素单体的生物合成。对bmr-6突变体和野生型进行了表达差异基因分析,发现1052个基因有显著差异,其中166个基因表达下调,886个基因表达上调,这些基因可以归类为154个生理途径。在木质素生物合成途径中有11个关键酶基因表达上调。对11个基因的启动区进行分析,它们都包含MYB转录因子结合位点。进一步采用生物信息学和EMSA试验,表明MYB1可能参与木质素单体的合成调控。这一研究结果对于木质素生物合成途径的调控研究以及木质素基因工程育种具有重要意义。更多还原