高通量柞蚕微孢子虫快速诊断方法研究

【作者】 李佩佩； 米锐； 岳冬梅； 叶博； 赵振军； 张波； 王林美； 范琦；

【机构】 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所；

【摘要】 【背景】柞蚕微粒子病严重困扰柞蚕产业发展,对其病原微孢子虫进行准确诊断,是切断胚种传播、控制微粒子病的有效手段。分子诊断技术通过特异性扩增靶标基因达到诊断目的,灵敏度高,特异性好,广泛应用于病原微生物的检测。然而,现行柞蚕微孢子虫分子诊断存在PCR模板DNA提取繁琐耗时、通量低、干扰多等问题,严重制约了分子诊断技术在大规模微粒子病集中检测中的应用。【方法】本文建立了一种高通量的、集"DNA快速提取—PCR特异扩增—结果可视读出"于一体的柞蚕微孢子虫分子检测技术,实现了在多孔板上进行批量模板DNA的快速提取,结合高灵敏度的荧光定量PCR扩增技术,通过荧光信号进行结果的可视读出。并利用该技术对采集自辽宁和吉林放养区的3000例柞蚕样本进行大规模集中检测,对比镜检结果,评估该技术的检测灵敏度。【结果】该技术大大的优化了柞蚕微孢子虫模板DNA的提取过程:简单、快速、无需研磨等繁琐操作;多孔板上批量操作,通量高;室温操作,蒸汽污染风险低;解决了现行普遍采用的"蛋白酶K消化—酚氯抽提"方法易受柞蚕黑化现象和卵胶干扰的问题;取样量低,能活蛹取样。结合检测灵敏度高的荧光定量PCR,通过荧光信号使结果可视易读,避免了常规PCR繁琐的凝胶电泳操作。该技术应用于3000例柞蚕样本的集中检测,结果显示:该技术对辽宁地区900例蛹期样本,检测出89例感染微孢子虫的样本,检出率为9.89%,是现行镜检手段检测率(23/900,2.89%)的3.9倍;对辽宁地区的100例蚕卵,该技术检测出8例卵感染微孢子虫,而传统镜检却未能检测任何一例感染样本;对吉林放养区的2000例母蛾样本,该技术共检测出59例感染微孢子虫的样本,检出率为2.95%,是镜检检出率(5/2000,0.25%)的11.8倍。【结论】本文建立了一种柞蚕微孢子虫分子诊断技术,该方法简单、快速、通量高,解决了现行柞蚕微孢子虫模板DNA提取过程中的常见问题;该技术检测灵敏度高,显著高于现行镜检技术,有望应用于柞蚕种质资源保护和生产中,能显著提高种茧质量,有效控制微粒子病的爆发。更多还原