响应面分析法优化固定化细胞生产L-苯丙氨酸的研究

【作者】 李铭； 杨顺楷； 杨亚力；

【机构】 成都理工大学； 中国科学院成都生物研究所；

【摘要】 L-苯丙氨酸(L-Phe)又名L-苯基-α-氨基酸,在自然界中广泛存在于卵、乳和动物蛋白中,是生物体内合成酪氨酸的重要原料,人体必需的八种氨基酸之一。L-Phe的最重要用途是合成阿斯巴甜以及用作营养强化剂,氨基酸输液和复合氨基酸制剂的成分。近年来,随着阿斯巴甜的广泛生产与使用,以及L-Phe类抗癌药物,营养保健品的开发应用,全球对L-Phe的需求量迅速急增,是达到万t/a级水平的第三个大宗氨基酸产品。苯丙氨酸解氨酶(PAL)法制备L-Phe成本低,不需辅助因子,工艺路线简单易操作,是国内首次投入工业化生产(100t/a级)L-Phe的生产线,3家企业共计已利用红酵母整细胞工艺生物转化肉桂酸生产L-Phe达2000t产量。此法中PAL酶活是控制产酸的关键,而PAL处于高PH值,高离子浓度这一反应介质体系内活性不稳定,导致不可逆的失活。为了提高生物催化剂——红酵母细胞的有效利用率,延长生物催化剂使用寿命,改进反应工艺,本工作开展了固定化粘红酵母(Rhodotorula glutinis CIBAS A 1401)细胞作为生物催化剂PAL酶法合成L-Phe优化工艺研究。用聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、海藻酸钙等物质作为细胞固定的载体材料,采用合适的方法进行固定化。以酶活的保留率,生物转化过程中包埋材料的稳定性为考察指标。最终选择以聚丙烯酰胺为包埋载体材料,并以酶活保留率为指标,运用响应面法对包埋条件进行了优化。实验研究工作包括下面部分:1、对影响固定化过程的四个主要因素进行单因素实验。实验结果表明:单体浓度和交联剂浓度分别为:20%、1.5%;最适湿细胞包埋量:0.35g/ml;最适包埋时间:45min。2、全因子实验设计(Full Fractorial Design FFD)法筛选重要因素。取FFD设计中两水平的实验设计方法,以用最少实验次数达到使因素的主效应得到尽可能精确的估计,从而选出最重要的几个因素,供进一步实验。选用4因子2水平的2~4设计,共进行16次实验,中心点做4次重复共需20次实验。使用STASTISTICA软件对实验结果进行回归分析得到,单体浓度和包埋量对酶活回收率影响显著,且适当减少单体浓度,增加包埋量对酶活回收率的提高有促进作用。3、应用最速上升法实验接近重要因素的最优水平。以20%的单体浓度(A)和0.35g/ml的包埋量(B)为中心点,共进行了5次实验,得出A:16.66%,B:0.4166g/ml时酶活回收率最高。4、应用响应面分析实验设计法确定重要因素的最优水平。以单体浓度(A)和包埋量(B)二因素为自变量,酶活回收率为响应值,采用二次回归的旋转中心组合设计,以最速上升法得到的最优点为中心点。将得到的实验结果用SAS统计软件进行数据回归拟合,并对拟合方程做显著性检验及方差分析。所得到拟合方程对自变量求偏导数方程,得到一个二元一次方程组,求解此方程组得到最大酶活回收率对应的最适条件为:单体浓度:16.7%;湿细胞包埋量:0.43g/ml。通过以上实验得出固定化粘红酵母细胞酶法合成L-Phe的最优包埋条件为:单体浓度:16.7%;交联剂浓度:2.0%;湿细胞包埋量:0.43g/ml;包埋时间:45min。在此条件下得到的固定化酶活回收率可达63%,较优化前提高了31%。对实验过程中的数据分析可以发现,单体浓度对固定化酶活影响最大,高浓度的单体会使聚丙烯酰胺凝胶的网格结构致密,遮蔽了PAL酶活性位点,而使固定化酶活性降低,所以要降低单体浓度。但过低的单体浓度聚合形成的凝胶网格孔径较大,也会造成固定化酶活性的丢失。随着细胞包埋量的增加,固定化细胞的表观活性和酶活回收率也随之增加,但过大的包埋量会使载体中酶催化位点分布稠密,反应位阻增大,固定化细胞的表观活性和酶活回收率反而降低。从响应面法实验数据的分析发现,单体浓度和细胞的包埋量之间的交互作用不明显。对固定化细胞的"活化"、向固定化载体中添加效应剂对固定化细胞酶活的提高"正在研究中。更多还原