超嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21的耐热酸性α-淀粉酶的性质、酶基因的克隆和表达

【作者】 王淑军； 陆兆新； 吕明生； 秦松； 刘红飞； 邓祥元； 林谦； 陈建安；

【机构】 南京农业大学食品科技学院； 江苏省海洋生物技术重点建设实验室淮海工学院； 中国科学院海洋研究所；

【摘要】 超嗜热微生物（Hyperthermophiles）主要为最适生长温度为80-110℃范围的古细菌（Archaeal）和细菌^[1]。目前工业用α-淀粉酶主要来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,这些酶的最适作用条件为90℃和pH 6,存在的主要问题是热稳定性差,高于100℃和pH低于6.0时易失活,且热稳定性依赖Ca^2+[2]。来源于超嗜热菌的α-淀粉酶能在高温下作用且具有很好的热稳定性而成为目前研究的热点。本研究对一株来自深海热液口的菌株HJ21进行了生理生化特征和16S rDNA的分析,初步鉴定为热球菌属Thermococcus。菌株.HJ21为嗜热厌氧古生菌,最适生长温度为88℃,最适生长pH为6.5。该菌株产生的胞外耐热的高温酸性α-淀粉酶,其分子量为5l.4KDa,酶的最适作用温度为95℃,在100℃仍有60%的酶活力。酶在90℃的半衰期为5h,在100℃2h仍有40%的残余酶活,酶的热稳定性不依赖Ca²⁺。酶的最适作用pH 5.0,在pH4.5仍有80%的酶活力,pH在5.5-7.0较稳定（80℃4h）。金属离子1mM的Mg²⁺、Co²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、K⁺、Na⁺对酶有激活作用,Cu²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺对该酶均有抑制作用。1mM的尿素、碘乙酸、TCA和DDT溶液对酶的抑制作用较弱,而lmM和5mM NBS对酶的活性具有较强抑制作用。利用PCR方法从嗜热古菌Thermococcus sp.HJ2l克隆了耐热α-淀粉酶基因并在大肠杆菌得到表达。酶基因序列分析阅读框为1374bp编码457个氨基酸。通过对该序列的同源性比较分析发现,嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产生的α-淀粉酶具有4个保守区,嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21与Thermococcus hydrothermalis和Thermococcus sp.OGL-20P的亲缘关系最近,序列相似度达到95%以上:利用Swiss Model预测该基因产物的三级结构,显示其具有典型的（β/α）₈桶状结构。更多还原