通过噬菌体展示和酵母细胞展示技术在细胞中构建一条全新的泛素化途径

【作者】 金博； 彭康莉； 王步帆； 刘香男； 叶琳； 赵博；

【机构】 上海交通大学药学院；

【摘要】 泛素化是细胞中非常重要的翻译后修饰过程,参与蛋白质降解、细胞信号传导等功能。泛素通过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2以及泛素连接酶E3的级联反应,传递到蛋白底物,形成泛素长链。在泛素化过程中,泛素连接酶E3具有底物特异性,起到了决定作用。然而,确定E3的底物特异性是一个难题,这是因为细胞中的600多个E3,识别几万个蛋白底物,E3与底物之间存在复杂的交叉作用,采用传统的方法,例如基因敲除E3,底物还会从其他E3接受泛素。为了解决这一难题,我们提出了一个创造性的办法,即通过噬菌体展示技术和酵母细胞展示技术,在细胞中引进一条全新的泛素化途径。在这个新途径中,所采用的泛素及其E1, E2和E3,全部由突变体构成,这些突变体不和细胞中任何野生型酶或者野生型泛素反应,而只能与其他突变体反应,从而在细胞中产生了一条和野生型途径并存又互不干扰的泛素途径。此途径可以将泛素突变体Ub (xUb)传递到底物上,再通过检测xUb上所携带的标签,就可以确定xUb与哪些蛋白结合,则这些蛋白就是此特定E3的底物,随后再采用细胞生物学手段来验证这些底物。通过这个办法,只要选择不同的E3,就可以确定出不同的E3所对应的底物。更多还原