鸡传染性支气管炎病毒的纯化及鉴定

【作者】 李佳； 梁超； 李杨会； 麻凯凯； 李永欣； 周景明；

【机构】 郑州大学；

【摘要】 背景:传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）是引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道系统、泌尿生殖系统及消化系统传染疾病。这种病毒在蔗糖溶液中的浮密度不同,跨度大,其峰值通常在1.15～1.189/mL范围内,这一特性使得超离提纯该病毒时在蔗糖梯度中难以得到单一的病毒区带。病毒的纯化是进行病毒的物理特性、化学组成、免疫特性等研究的前提和基础。目的 :本试验以IBV M41株为材料,对IBV的纯化方法进行探索,对该病毒的提纯方法及在梯度离心溶液中的病毒富集带进行分析和总结,以便能更深入地了解M41株的生物学特性以便进行其单克隆抗体的研制。方法 :采用超速离心和密度梯度离心相结合的方法纯化IBV尿囊液,用蔗糖作介质。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株接种SPF鸡胚进行病毒增殖,收获的尿囊液先进行超速离心使之浓缩,超速离心条件为35000r/min,4℃,2h,弃上清,加入少量PBS将沉淀吹打至溶液状态。然后再进行蔗糖密度梯度离心,用PBS缓冲液制备30%、45%、60%（W/W）蔗糖浓度梯度。按浓度从高到低用移液器缓慢地将不同浓度蔗糖溶液加入超速离心管中,制备蔗糖密度梯度层。将上步PBS重悬得到的溶液加到蔗糖梯度层上部,42000 r/min,4℃,3h进行蔗糖密度梯度离心,收集45%蔗糖溶液附近的病毒带。用PBS缓冲液重新悬浮,35000 r/min,4℃,超速离心3h,去除蔗糖。使用电镜观察IBV形态。经过SDS-PAGE和Western blotting鉴定病毒后,用紫外分光光度计测提纯病毒的OD₂₆₀和OD₂₈₀值。结果 :密度梯度离心后在45%梯度层的中上部有一条明显的乳白色病毒样带。电镜可观察到IBV病毒粒子基本形态,但存在纤突蛋白脱落现象。SDS-PAGE电泳后观察到在43 kDa附近有一条明显的条带。Western blotting时在PVDF膜上相应位置出现明显的蓝色条带。经计算得到稀释的纯化病毒浓度为15.27μg/mL。结论 :采用超速离心和密度梯度离心相结合的方法成功纯化了IBV,为进一步提高IBV的纯化效果提供了参考。更多还原