柑橘春化过程中VRN2的表达及其与DNA甲基化的相关性

【作者】 艾小艳； 张金智； 胡春根；

【机构】 湖北省农业科学院果树茶叶研究所； 华中农业大学园艺林学学院；

【摘要】 在模式植物中,春化记忆过程与PolycombGroup(PcG)蛋白介导的组蛋白甲基化有关。VERNALIZATION2(VRN2)参与形成的Polycomb Repressive Complex 2(PRC2)复合体(VRN2-PRC2)通过组蛋白甲基化修饰影响春化过程。本研究中克隆柑橘VRN2基因,研究其在春化过程中甲基化水平及其与表达差异的相关性,为探明VRN2-PRC2在柑橘春化过程中的表观调控机制提供数据支持。克里曼丁材料来自华中农业大学国家柑橘育种中心种质资源圃。于2011年12月—2012年4月采集成年期树体春梢顶端5个芽作为材料。取样后置于液氮中速冻并在–80℃条件下保存备用,每个样品3个生物学重复。利用柑橘基因组数据库,克隆柑橘VRN2基因的CDS序列和DNA序列,实时荧光定量分析其在春化过程中的表达差异,采用亚硫酸氢盐测序技术(BSP)研究其甲基化水平差异。柑橘VRN2基因的CDS序列全长1 416 bp,编码471个氨基酸,蛋白分子质量约53.7kD,等电点约6.09。柑橘VRN2氨基酸序列与拟南芥基本一致,其N端有VEFS-Box基序。通过EMBOSS CpG Plot Tool软件分析,在VRN2启动子序列中预测到1个CpG岛区域,在–370 bp～–779 bp区域内。用PlantCARE软件预测了该区域,包含TATABOX、WRKY7等元件。通过qRT-PCR检测发现,VRN2在春化过程中,低温环境阶段表达量高于温暖阶段。用BSP技术检测了柑橘VRN2基因在启动子区CpG岛区的甲基化水平。在低温阶段,VRN2表达量高,甲基化水平高,而温暖阶段表达水平低,甲基化水平也较低,表明VRN2在春化过程中的表达水平与DNA甲基化呈正相关。在拟南芥中VRN2 m RNA并不受春化诱导,春化前后水平类似,但其蛋白水平随低温处理时间的延长逐渐增加,回到温暖环境中时又急剧下降,说明春化过程对VRN2进行转录后调控。本研究中,柑橘VRN2 m RNA水平在春化过程中,低温环境中表达量高,在温暖环境时表达量降低,说明柑橘VRN2基因在春化过程中受转录调控。推测柑橘VRN2基因响应春化过程机制与模式植物拟南芥中存在差异。通常认为,启动子区DNA甲基化水平的提高会抑制基因的表达,去甲基化会激活某些基因的表达。而本研究中,柑橘VRN2基因m RNA的表达水平与DNA甲基化水平呈正相关。因此推测,在春化过程中,DNA甲基化可能抑制VRN2启动子区域的负调控元件,从而促进VRN2基因表达;或者CpG岛的甲基化状态可能仅为VRN2基因转录调控过程提供了一些前提条件,其他调节机制如组蛋白共价修饰可能发挥更直接、更重要的作用。更多还原