节瓜CqWRKY31的表达分析与遗传转化

【作者】 杜翔斐； 王敏； 江彪； 彭庆务； 刘文睿； 林毓娥； 姚春鹏； 王永飞； 何晓明；

【机构】 暨南大学生物工程学系； 广东省农业科学院蔬菜研究所； 广东省蔬菜新技术研究重点实验室；

【摘要】 节瓜（Benincasa hispida Cogn. var. chieh-qua How.）是中国华南地区的主要蔬菜作物,节瓜枯萎病是尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）引起的土传病害,发掘抗性相关基因,对于创制节瓜抗性资源、开展抗病育种研究具有重要意义。WRKY转录因子是广泛存在于植物界中的一类重要转录调控因子,参与植物对逆境的响应,特别是参与植物对病原体的防卫反应。本课题组前期发现WRKY家族基因与节瓜枯萎病抗性相关,并克隆了一系列节瓜WRKY基因,并认为CqWRKY31可能为枯萎病抗性正调节子。本研究对CqWRKY31基因在镰刀菌酸胁迫下的表达进行了分析,并开展了该基因的亚细胞定位和遗传转化,获得了转基因植株,为开展节瓜抗枯萎病机理研究奠定了基础。利用qRT-PCR方法检测CqWRKY31在不同胁迫下的表达量变化;采用In-Fusion方法构建过表达CqWRKY31载体和含有GFP标签的瞬时表达载体;利用农杆菌注射烟草下表皮的方法对CqWRKY31进行亚细胞定位。结合农杆菌侵染子叶节的方法进行节瓜品种的遗传转化,结合琼脂糖检测和半定量RT-PCR对转基因植株进行表达量的检测。研究发现CqWRKY31在枯萎病毒素镰刀菌酸（FA）胁迫后,表达量先上升后下降,且在抗病品种的表达量显著高于感病品种;茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸酸（SA）等胁迫时该基因被诱导表达。通过农杆菌注射法1305-GFP-CqWRKY31融合载体在烟草叶片中的瞬时表达,表明该基因定位于细胞核中。为进一步研究该基因的功能,以节瓜子叶节为外植体,优化了节瓜遗传转化体系,在农杆菌浓度OD₆₀₀为0.3时侵染10 min,共培养3 d,以500 mg·L^-1的头孢霉素为抑菌抗生素,对CqWRKY31过表达载体进行遗传转化,并获得了拟转基因植株。经过PCR和RT-PCR鉴定,共获得阳性苗21株,移栽成活9株。通过半定量PCR发现阳性植株CqWRKY31的表达量显著高于对照。此外,外源FA处理时发现,与阳性转基因植株相比,对照植株的苗期叶片和叶柄变黑面积较大,叶萎蔫程度较高,且全株枯死的比例较高,说明CqWRKY31过表达植株对枯萎病的抗性增强,该基因正向调控节瓜枯萎病抗性。本研究为揭示WRKY类转录因子在节瓜枯萎病抗性方面的分子机理提提供了理论依据,为节瓜枯萎病抗性育种的遗传改良奠定了基础;同时也可为其他瓜类作物开展WRKY基因与抗枯萎病研究提供借鉴依据。更多还原