萝卜CRISPR/Cas9高效表达载体系统

【作者】 张晓雪； 张晓辉； 宋江萍； 邱杨； 王海平； 李锡香；

【机构】 中国农业科学院蔬菜花卉研究所；

【摘要】 中国是萝卜的起源地之一,拥有丰富的地方品种和种质资源。但是,萝卜是一种再生顽拗型植物,遗传转化困难,制约了萝卜的功能基因组研究和基因工程育种。CRISPR/Cas9是一种广泛应用于人类细胞及动植物的基因编辑工具。但在萝卜中尚无成功的案例报道。为了建立萝卜的基因编辑技术,本研究中构建了3个萝卜特异性CRISPR/Cas9高效表达载体系统。通过序列比对从萝卜基因组中检索U6基因,提取U6基因上游序列,根据U6启动子特征元件确定萝卜U6启动子片段。从萝卜基因组DNA中PCR扩增出2个U6启动子,利用infusion无缝克隆方法替换CP024(中国农业科学院蔬菜花卉研究所崔霞研究员惠赠)载体上的番茄U6启动子,获得2个萝卜U6启动子驱动sgRNA的CRISPR/Cas9载体。随后,在其中一个载体的LB和RB处分别装载甘蓝卷叶病毒(CaLCV)的CR和AL-CR片段,以增强CRISPR/Cas9在植物细胞中的拷贝数。随后,针对萝卜PDS基因设计sgRNA,利用GoldenGate克隆法构建靶向载体,电转农杆菌,侵染萝卜外植体及萌发的种子,并转化拟南芥,检验这3个载体的基因编辑效率。通过测序,证明所构建的3个载体与设计相符。通过调整buffer和优化反应流程,提高了sgRNA的装载效率。利用靶向PDS基因的构建物转化拟南芥,在T0代即可获得具有突变表型的植株。利用该载体侵染萝卜外植体,可获得白色愈伤组织;侵染萌发的萝卜种子,7d后观察到子叶上形成少量白化斑块。通过PCR和酶切检测,获得突变型条带。表明这3个CRISPR/Cas9载体可以在萝卜细胞中实现基因编辑。这套专门针对萝卜设计的高效CRISPR/Cas9表达载体系统将为萝卜基因功能研究、新种质创制以及萝卜与其他物种远缘杂交后的染色体工程研究提供有用的工具。更多还原